交聯(lián)染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）方案
用法說明
ChIP（染色質(zhì)免疫共沉淀）是一種用于研究蛋白與DNA之間自然狀態(tài)下相互作用的技術(shù)。它依賴于特定抗體與抗原的特異性反應(yīng)，因此能夠真實(shí)地反映蛋白因子與基因組DNA在體內(nèi)的結(jié)合情況。目標(biāo)蛋白與DNA被交聯(lián)在一起，然后通過聲波或酶切將DNA打斷成小片段。通過抗體與抗原之間的特異性反應(yīng)，我們可以沉淀下預(yù)測的DNA片段。這個(gè)過程特異性地富集了與目標(biāo)蛋白結(jié)合的DNA片段。最后，我們可以從復(fù)合物中純化DNA，并根據(jù)PCR或qPCR方案驗(yàn)證DNA。
溶液和試劑
ChIP溶解緩沖液：1% TritonX-100，0.1% NaDOC，0.1% SDS，1mM EDTA（pH8.0），140mM NaCl，50mM Tris-HCl（pH8.0）
RIPA緩沖液：1% NP-40，0.5% NaDOC，0.1% SDS，2mM EDTA（pH8.0），150mM NaCl，50mM Tris-HCl（pH8.0）
低鹽洗滌緩沖液：1% TritonX-100，0.1% SDS，2mM EDTA（pH8.0），150mM NaCl，20mM Tris-HCl（pH8.0）
高鹽洗滌緩沖液：1% TritonX-100，0.1% SDS，2mM EDTA（pH8.0），500mM NaCl，20mM Tris-HCl（pH8.0）
LiCl緩沖液：0.25M LiCl，1% NP-40，1% NaDOC，1mM EDTA，10mM Tris-HCl（pH8.0）
TE緩沖液：1mM EDTA，10mM Tris-HCl（pH8.0）
洗脫緩沖液：1% SDS，100mM NaHCO3
樣品制備
● 交聯(lián)和裂解-轉(zhuǎn)錄因子和輔助因子
細(xì)胞在10厘米培養(yǎng)皿中以20毫升培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%至90%時(shí)，可用于進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞數(shù)量的選擇取決于您研究的目標(biāo)蛋白質(zhì)。您可以參考以下表格：
| 蛋白質(zhì) | 細(xì)胞數(shù)（用于ChIP反應(yīng)） | 蛋白靶豐度 |
|---|---|---|
| 組蛋白蛋白質(zhì)RNA聚合酶II | 104 | 高 |
| 轉(zhuǎn)錄因子 | 105-106 | 中等 |
| 輔因子 | 107?或更多 | 低 |
為了獲得更好的結(jié)果，對(duì)于組蛋白蛋白和RNA聚合酶II，我們建議使用超過4×106個(gè)細(xì)胞，而轉(zhuǎn)錄因子或輔因子可能需要更多細(xì)胞。我們使用1%的甲醛作為交聯(lián)劑，將蛋白質(zhì)與DNA交聯(lián)在一起。這個(gè)過程是時(shí)間依賴性的，所以我們需要針對(duì)不同的細(xì)胞進(jìn)行優(yōu)化。交聯(lián)不足會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果，而過度交聯(lián)可能會(huì)掩蓋表位，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。我們建議將樣品交聯(lián)10分鐘。交聯(lián)反應(yīng)可以通過甘氨酸來逆轉(zhuǎn)。
1. 將培養(yǎng)皿取出，向20ml培養(yǎng)基中加入550μl的37%甲醛。充分混合，使最終甲醛濃度達(dá)到1%。
2. 將培養(yǎng)皿放置在室溫下靜置10分鐘。這個(gè)過程是蛋白質(zhì)和DNA之間的交聯(lián)反應(yīng)，時(shí)間不宜過長，否則會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果。
3. 加入125mM甘氨酸溶液終止交聯(lián)反應(yīng)。輕輕混合溶液。
4. 將培養(yǎng)皿放置在室溫下靜置5分鐘。
5. 去除培養(yǎng)基，用冰冷PBS洗滌細(xì)胞3次。
6. 向培養(yǎng)皿中加入含有蛋白酶抑制劑的1ml冰冷PBS，并迅速刮取細(xì)胞。
7. 用適量的PBS洗滌培養(yǎng)皿底部2次。將PBS吸入步驟6中的離心管中。
8. 以2500rpm、4℃離心3分鐘，收集沉淀物。
9. 向細(xì)胞懸浮液中加入適量的ChIP裂解緩沖液（2×107細(xì)胞使用1ml），在冰上裂解細(xì)胞15分鐘。
10. 超聲處理細(xì)胞，以打斷DNA，理想的DNA片段大小為200-1000bp。超聲處理的條件因細(xì)胞類型和使用的設(shè)備而異。對(duì)于每種細(xì)胞，您需要探索相應(yīng)的超聲處理?xiàng)l件。
11. 以12000rpm、4℃離心10分鐘。
● 聲處理
超聲處理過程也是時(shí)間相關(guān)的。理想的DNA片段大小為200-1000bp，需要根據(jù)不同的細(xì)胞系進(jìn)行優(yōu)化。
1. 超聲處理細(xì)胞，打斷DNA，理想的DNA片段大小為200-1000bp。超聲處理的條件因細(xì)胞類型和使用的設(shè)備而異。對(duì)于每種細(xì)胞，您需要探索相應(yīng)的超聲處理?xiàng)l件。
2. 以12000rpm、4℃離心10分鐘。將上清液分離到一個(gè)新的離心管中。
3. 取50μl上清液進(jìn)行瓊脂糖凝膠分析，以驗(yàn)證超聲處理的效果。
● DNA片段的測定
1. 將70μl洗脫緩沖液加入50μl染色質(zhì)中。
2. 加入4.8μl 5M NaCl和2μl 10mg/ml RNase A，在65℃孵育過夜。目的是去除RNA的干擾。
3. 加入2μl 20mg/ml蛋白酶K，在60℃孵育1小時(shí)。目的是打斷蛋白與DNA之間的反應(yīng)，并有助于DNA的純化。
4. 使用DNA純化試劑盒富集DNA，或進(jìn)行苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀法。
5. 使用2%瓊脂糖凝膠檢測超聲處理效果。
免疫沉淀反應(yīng)
1. 將包含來自1×107細(xì)胞的DNA的500μl染色質(zhì)（用RIPA緩沖液稀釋）轉(zhuǎn)移至離心管，并取50μl染色質(zhì)作為輸入組。
2. 在免疫沉淀前，您需要設(shè)計(jì)四組實(shí)驗(yàn)：
- 實(shí)驗(yàn)組：將2-5μg特異性初級(jí)抗體加入500μl染色質(zhì)中，并將離心管放置在4℃的旋轉(zhuǎn)混合器上過夜，形成抗原-抗體復(fù)合物。
- 輸入組：除了免疫沉淀反應(yīng)外，所有步驟都與實(shí)驗(yàn)組相同。
- 陰性對(duì)照組：所有步驟與實(shí)驗(yàn)組相同，但使用正常兔IgG代替抗體。
- 陽性對(duì)照組：所有步驟與實(shí)驗(yàn)組相同，但使用組蛋白H3或RNA聚合酶II抗體代替抗體。
3. 在4℃下將50μl磁珠加入復(fù)合物溶液中，孵育2-4小時(shí)。
4. 將磁珠吸附在磁架上并去除上清液。
洗掉珠子
1. 使用過濾吸頭對(duì)磁珠進(jìn)行洗滌:
- 2×1ml 低鹽洗滌緩沖液
- 2×1ml 高鹽洗滌緩沖液
- 2×1ml LiCl洗滌緩沖液
- 2×1ml TE緩沖液
依次使用上述緩沖液對(duì)磁珠進(jìn)行兩次洗滌。每次使用吸頭吸液3-8次，并旋轉(zhuǎn)攪拌10分鐘。
2. 使用磁架去除洗滌緩沖液并收集沉淀復(fù)合物。
反交聯(lián)
1. 將120μl洗滌緩沖液加入沉淀復(fù)合物中，在旋轉(zhuǎn)混合器上以室溫慢慢混合15分鐘。
2. 重復(fù)上述步驟一次。
3. 使用磁架將上清液收集到一個(gè)新的管中。
4. 將9.6μl 5M NaCl和2μl 10mg/ml RNase加入所有組中，然后在65℃水浴中過夜以解除交聯(lián)作用。
5. 加入2μl 20mg/ml蛋白酶K，在60℃孵育1小時(shí)。
DNA純化
您可以根據(jù)提取試劑盒的說明書進(jìn)行DNA提取，或者使用苯酚-氯仿萃取和乙醇沉淀方法進(jìn)行提取。
