免疫沉淀（IP）方案
原理
免疫沉淀實驗基于抗原與特異性抗體的相互作用關系，實現(xiàn)對目標蛋白質(zhì)的富集。
其原理是在細胞裂解液中加入抗目的蛋白的抗體，孵育后再加入與抗體特異結(jié)合的結(jié)合于sepharose beads上的proteinA/G, 與細胞中有目的蛋白結(jié)合，就形成一種免疫復合物，經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，復合物又被分開。然后經(jīng)免疫印跡或質(zhì)譜檢測目的蛋白。
免疫沉淀的操作過程主要分三個階段：第一步是制備抗原溶液，任何抗原溶液均可作為免疫沉淀的材料來源，一般采用細胞或組織制備的裂解物；第二階段是對裂解物進行預處理，免疫沉淀要求抗原的純度盡可能高，用不與待檢抗原結(jié)合的非特異性抗體預處理，可以從抗原溶液中除去非特異性結(jié)合蛋白；最后階段是免疫復合物的形成與純化，即在預處理過后的裂解物中加入特異性抗體形成免疫復合物，然后將免疫復合物經(jīng)蛋白A或蛋白G結(jié)合的瓊脂糖或聚丙烯酰胺微珠等固相基質(zhì)進行純化。蛋白A和蛋白G對抗體的Fc段有較高的親和力。蛋白A/G 與抗體結(jié)合后，通過洗滌微珠即可除去未結(jié)合的蛋白，剩下與基質(zhì)結(jié)合的即是純化的抗原抗體復合物。
用途
用于分離和富集含有特定蛋白質(zhì)的物質(zhì)。
步驟
1. 樣品準備
● 細胞裂解物樣品的制備
(1) 以預冷的PBS中懸浮細胞，以2500rpm,4℃ 離心2分鐘，收集細胞。
(2) 加入含有蛋白酶抑制劑的預冷的RIRA 緩沖液來懸浮細胞(每107個細胞 加1ml)。
(3) 用適當功率的超聲波處理細胞3分鐘。
(4) 將緩沖液放在冰上20-30分鐘。
(5) 4℃,12000rpm 離心20分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到新的管中，通過BCA法測定蛋白濃度。樣品可在-80℃長期冷凍保存，但建議使用新鮮的樣品。
● 組織樣本的制備
(1) 解決動物問題，獲得你需要的組織。用冰冷的PBS 緩沖液把血洗掉。
(2) 用液氮研磨組織，然后超聲波處理5分鐘。然后進行與細胞裂解樣品制備相同的過程。
2. 免疫沉淀反應
(1) 取500ul含有0.5-1mg 蛋白質(zhì)的細胞裂解液于管中。
(2) 加入3-5μg一抗，4℃孵育過夜。
(3) 在溶液中加入50ul磁珠，捕獲抗原抗體復合物，4℃2-4h。
(4) 用磁分離架收集抗原-抗體-磁珠復合物。
3. 洗滌和洗脫或熱變性
● 洗滌
有兩種方法用于洗滌磁珠，酸洗脫或熱變性。前者適用于任何大小的蛋白 質(zhì)，它具有較低的背景。后者比較方便，但G 蛋白或A 蛋白會煮到上清，影響結(jié)果。
用一系列洗滌緩沖液清洗抗原-抗體-磁珠復合物，如下所示：
(1)1ml RIPA緩沖液
(2)1ml PBST緩沖液
(3)1mlPBS 緩沖液
每個緩沖液2次，4℃離心2500rpm
● 酸洗脫
(1) 用50ul150mM甘氨酸-鹽酸(pH1.5～2.5) 洗脫緩沖液洗脫2次。
(2) 加入2ul Tris-HCl(pH9.4)中和洗脫液。
(3) 加入20ul 6×loading buffer,100℃加熱5分鐘。
● 熱變性
(1) 根據(jù)抗原-抗體-磁珠復合物的體積加入loading buffer。
(2) 在100℃下煮沸抗原-抗體-磁珠復合物10分鐘。
(3) 將上清液轉(zhuǎn)移到新管中。
4. 檢測
用WB 檢測了IP反應的結(jié)果。參考WB 方案將蛋白質(zhì)樣品裝入SDS-PAGE 凝膠中。輕鏈和重鏈干擾在檢測中很常見。如果目標蛋白的分子量接近55kD, 建議用輕鏈抗體作為二抗。如果目標蛋白的分子量接近25kD,我們推薦 HRP- 蛋白 A/G 作為二抗。
常見問題
1. 高背景
(1) 去污劑不溶性蛋白有殘留
離心后立即去除上清。沉淀中留有不溶性蛋白質(zhì)，如果再次有懸浮發(fā)生，再次離心。
(2) 洗滌不充分
蓋上管蓋離心前反復顛倒幾次。
(3) 使用的抗體特異性不夠。
使用親和純化的抗體，最好預先吸收。
(4) 使用太多抗體導致非特異性結(jié)合
檢查推薦抗體用量。嘗試使用更少的抗體。
(5) 細胞裂解液中含有太多的細胞或太多蛋白質(zhì)，導致洗脫液中有很多額 外的(假陽性)蛋白質(zhì)。
減少細胞數(shù)量/裂解液使用。我們推薦使用10-500 μg 細胞裂解液。
(6) 蛋白與抗體非特異性結(jié)合
如果有很多非特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，可以嘗試減少上樣珠子的樣本數(shù)量。您 還可以在開始免疫沉淀實驗之前預先孵育珠子和準備好的裂解液(請參閱 實驗方案)來預清除裂解液。這應該清除裂解液內(nèi)任何與珠子非特異結(jié)合 的蛋白質(zhì)。 一些研究人員也使用同種來源和相同免疫球蛋白亞類的無關抗 體來預清除裂解液。
(7) 免疫沉淀實驗時抗原降解
確保樣品裂解時加入新鮮的蛋白酶抑制劑。
2. 大量抗體被洗脫
太多抗體與目標蛋白質(zhì)洗脫嘗試減少抗體用量。免疫沉淀前將抗體與珠子 交聯(lián)，并使用溫和的甘氨酸緩沖液梯度洗脫將大大減少抗體洗脫量。
3. 沒有檢測到目的蛋白洗脫
(1) 所用樣品中不表達或低水平表達目標蛋白質(zhì)
檢查目標蛋白質(zhì)的表達譜，以確保它會在您樣品的細胞表達。如果有目標 蛋白低水平表達，增加裂解液的使用量。但是，這可能導致增加非特異性結(jié)合，所以開始免疫沉淀程序之前最好預先清除裂解液。
(2) 沒有足夠的抗體捕獲目標蛋白
檢查抗體的建議使用量?？贵w濃度可能需要增加。
(3) 目標蛋白沒有從珠子上洗脫
確保您使用的洗脫緩沖液是正確的，并且是洗脫蛋白質(zhì)所需的正確強度和pH 值。
(4) 抗體沒有結(jié)合免疫吸附磁珠
確保您使用的珠子與抗體亞型匹配。
(5) 使用的裂解液不正確
檢查說明書，看看抗體是否能檢測變性蛋白質(zhì)或天然蛋白質(zhì)，并確保使用 正確的裂解液。
