免疫熒光（IF）方案

用途

檢測細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原的定位或相對表達。

步驟

1. 樣品準(zhǔn)備

● 細(xì)胞樣品的制備

熒光顯微鏡用于檢測熒光信號。為了與該設(shè)備兼容，細(xì)胞需要在特定的材料上培養(yǎng)。典型的包括玻璃底細(xì)胞培養(yǎng)皿和玻璃蓋片。細(xì)胞密度不宜過大。

● 組織樣本的準(zhǔn)備

石蠟切片需要脫蠟、水化和抗原修復(fù)步驟(參考免疫組化方案),然后與抗體 孵育進行熒光檢測。

冷凍切片應(yīng)先在室溫平衡10-20min。 然后，切片用4%甲醛固定10-15min。 用0.2% TritonX-100 滲透20min, 并對細(xì)胞樣品進行滲透。

2. 固定和滲透作用

樣品的固定和滲透是決定實驗成功的關(guān)鍵步驟。醛基固定劑(如甲醛、福爾馬林和戊二醛)和脫水固定劑(如乙醇)常被用作固定劑?；谌┑墓潭▌┐┻^細(xì) 胞膜，也可以與細(xì)胞蛋白質(zhì)交聯(lián)，穩(wěn)定和硬化樣品。與脫水固化劑相比，醛基固化劑效果更好。所以我們建議用4%的甲醛固定細(xì)胞。為了使抗體接觸到目標(biāo)蛋白，需要進行滲透作用。洗滌劑常被用作滲透試劑。推薦使用TritonX- 100。它能破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞膜上形成許多小孔。這些小孔為抗體提供了一個通道，使其能夠接觸到目標(biāo)蛋白質(zhì)。與醇類相比，醛類能更好地穿過質(zhì)膜并固定可溶性蛋白，但某些靶標(biāo)在醛類交聯(lián)時會失去抗原性。

(1) 用PBS 沖洗細(xì)胞三次。

(2) 用4%甲醛固定細(xì)胞10-15min

(3) 用PBS 沖洗細(xì)胞三次。

(4) 用1% Triton X-100于室溫滲透細(xì)胞20分鐘。

(5) 用PBS 沖洗細(xì)胞三次。

3. 封閉

這一過程是為了減少抗體與其他非特異性蛋白質(zhì)之間的非特異性結(jié)合。我 們常用的阻斷液是正常的山羊血清(品種必須與二抗一致)。血清不僅能阻斷非特異性結(jié)合蛋白，還能阻斷細(xì)胞或組織中的FC受體。

(1) 用10%正常山羊血清于室溫阻斷1h。

(2) 擦去多余的液體，保持樣品濕潤。

4. 抗體孵育

(1) 按照推薦的稀釋比例制備一抗溶液，使樣品完全覆蓋在一抗溶液中。

(2) 一抗4℃孵育過夜。

(3) 用PBS沖洗細(xì)胞三次。

(4) 按照推薦稀釋比例在暗處制備二抗溶液，使樣品完全覆蓋在一抗溶液。

(5) 二抗室溫孵育1h。

(6) 用PBS沖洗細(xì)胞三次。

5. 核染色

DAPI常被用作核試劑，以使細(xì)胞結(jié)構(gòu)更清晰。按說明書稀釋DAPI試劑，與樣品孵育適當(dāng)時間。染色時間不宜過長。

6. 檢測

將樣品置于黑暗中，盡快用熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描檢測熒光信號。

常見問題

1. 整個細(xì)胞片都出現(xiàn)熒光亮點?

(1) 二抗?jié)舛冗^高，適當(dāng)降低二抗?jié)舛燃纯伞?/p>

(2) 二抗發(fā)生沉淀，可以使用過濾或者離心熒光標(biāo)記二抗。

2. 信號弱或無信號，染色細(xì)胞過少?

(1) 目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中沒有表達；制備細(xì)胞裂解液，用 Westerm Bloting 驗證目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中是否表達；

(2) 表達目標(biāo)蛋白的細(xì)胞過少：標(biāo)本中使用更多的細(xì)胞，試用其他瞬時轉(zhuǎn)染方法，或者使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系；

(3) 細(xì)胞通透性差：增加通透劑作用的時間或者濃度，或改用其它的通透；

(4) 染色前的固定步驟破壞了抗原表位：改用其他固定方法；

(5) 通透處理使抗原丟失：減少通透劑作用的時間或強度；

(6) 抗體不識別：換用其他抗體；

(7) 一抗稀釋度過大：同一樣品按最佳的二抗用量作一抗稀釋曲線，以確定 更佳的一抗稀釋比例；

(8) 二抗選擇錯誤：使用正確的二抗。

3. 只有 DAPI 的藍光，目的熒光幾乎沒有或者很弱。

出現(xiàn)這種現(xiàn)象很有可能是抗體比例太低，需提高抗體濃度，可配合提高二抗 濃度；共聚焦的激發(fā)熒光強度不夠大；二抗是否是對應(yīng)的種屬，比如本來需要山羊抗鼠結(jié)果加為山羊抗免。

4. 細(xì)胞核周圍總是存在有一些藍色的小點點。

此種情況一般是支原體污染所致，建議用殺支原體藥2 周后再檢測，或者通 過提高共聚焦背景值來覆蓋支原體熒光。

5. 共定位的視野該如何選擇?

共定位時，首先判斷哪些細(xì)胞是轉(zhuǎn)染成功的，比如我過表達了蛋白A,想做蛋白A和蛋白B的共定位關(guān)系，則在視野中尋找已成功轉(zhuǎn)染蛋白A的細(xì)胞，一般熒光強度會顯著高于周邊其他細(xì)胞，再在這個細(xì)胞上觀察蛋白B的表達。

6. 視野中細(xì)胞之間存在散在的發(fā)光點。

有兩種情況可造成：

(1) 拍照時PBS量過少引起的非特異性；

(2) PBS未過濾，未溶解的殘渣黏附而導(dǎo)致。