天然染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）方案
用法說(shuō)明
ChIP（染色質(zhì)免疫沉淀）是一種用于研究蛋白與DNA在自然狀態(tài)下的相互作用的技術(shù)。它依賴于特定抗體與抗原的特異性反應(yīng)，因此能夠真實(shí)地反映蛋白因子和基因組DNA在體內(nèi)的結(jié)合情況。目標(biāo)蛋白與DNA進(jìn)行交聯(lián)，然后通過(guò)聲波破碎或酶切分解DNA成小片段。通過(guò)抗體和抗原之間的特異性反應(yīng)，我們可以沉淀下預(yù)測(cè)的DNA片段。這個(gè)過(guò)程特異性地富集了與目標(biāo)蛋白結(jié)合的DNA片段。最后，我們可以從復(fù)合物中純化DNA，并根據(jù)PCR或qPCR的協(xié)議驗(yàn)證DNA。
溶液和試劑
反應(yīng)緩沖液：1mM CaCl2，0.2% Triton X-100或NP-40，50mM Tris-HCl（pH 7.6）
RIPA緩沖液：0.1% SDS，0.1% NaDOC，1% Triton X-100，1mM EDTA，10mM Tris-HCl（pH 7.6）
LiCl緩沖液：0.25M LiCl，0.5% NP-40，0.5% NaDOC，10mM Tris-HCl（pH 7.6）
TE緩沖液：1mM EDTA，10mM Tris-HCl（pH 7.6）
樣品制備
交聯(lián)和裂解-轉(zhuǎn)錄因子和輔助因子
細(xì)胞在10厘米培養(yǎng)皿中以20毫升培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%至90%時(shí)，可用于進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞數(shù)量的選擇取決于您研究的目標(biāo)蛋白質(zhì)。您可以參考以下表格：
| 蛋白質(zhì) | 細(xì)胞數(shù)（用于ChIP反應(yīng)） | 蛋白靶豐度 |
|---|---|---|
| 組蛋白蛋白質(zhì)RNA聚合酶II | 104 | 高 |
| 轉(zhuǎn)錄因子 | 105-106 | 中等 |
| 輔因子 | 107?或更多 | 低 |
為了確保更好的結(jié)果，我們建議使用超過(guò)4×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行組蛋白和RNA聚合酶II的ChIP實(shí)驗(yàn)，而轉(zhuǎn)錄因子或輔助因子則需要更多的細(xì)胞。
1. 取出培養(yǎng)皿并倒掉培養(yǎng)基。細(xì)胞數(shù)量約為2×107個(gè)。
2. 用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞3次。
3. 添加1ml PBS，通過(guò)刮取的方式收集細(xì)胞。
4. 以2500轉(zhuǎn)/分鐘的速度，在4℃下離心3分鐘，收集細(xì)胞。
5. 通過(guò)向細(xì)胞中加入500μl反應(yīng)緩沖液（加入新鮮的蛋白酶抑制劑）來(lái)重新懸浮細(xì)胞，將其在冰上裂解10分鐘。
6. 以2500轉(zhuǎn)/分鐘的速度，在4℃下離心3分鐘，收集細(xì)胞。
7. 通過(guò)添加1ml反應(yīng)緩沖液和微量核酸酶，在37℃下反應(yīng)20分鐘。酶解條件應(yīng)參考微量核酸酶的說(shuō)明書。處理時(shí)間和微量核酸酶的濃度應(yīng)通過(guò)初步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。
8. 可以添加5mM EDTA來(lái)停止酶解反應(yīng)。
9. 使用超聲波打斷DNA，完全破碎。進(jìn)行6次5秒的超聲處理。
10. 以2500轉(zhuǎn)/分鐘的速度，在4℃下離心2分鐘。將上清液分離到一個(gè)新的管中。
11. 您可以取5μl上清液進(jìn)行瓊脂糖凝膠分析，以驗(yàn)證超聲處理的效果。
免疫沉淀反應(yīng)
1. 將包含來(lái)自1×107細(xì)胞的DNA的500μl細(xì)胞裂解液取出放入一個(gè)管中。
2. 在免疫沉淀之前，您需要設(shè)計(jì)四組實(shí)驗(yàn)：
- 實(shí)驗(yàn)組：將2-5μg特異性抗體加入500μl細(xì)胞裂解液中，并將管子放置在4℃旋轉(zhuǎn)混合器中過(guò)夜，形成抗原-抗體復(fù)合物。
- 輸入對(duì)照組：除了免疫沉淀反應(yīng)外，所有步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。
- 陰性對(duì)照組：除了使用正常兔子IgG代替抗體外，所有步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。
- 陽(yáng)性對(duì)照組：除了使用組蛋白H3或RNA聚合酶II抗體代替抗體外，所有步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。
3. 將50μl磁珠加入復(fù)合溶液中，在4℃下孵育2-4小時(shí)。
4. 將磁珠吸附在磁力架上，去除上清液。
洗掉珠子
1. 使用過(guò)濾吸頭對(duì)磁珠進(jìn)行洗滌:
- 2×1ml RIPA緩沖液
- 2×1ml RIPA緩沖液 + 0.3M NaCl
- 2×1ml LiCl緩沖液
- 2×1ml TE緩沖液 + 0.2% Triton X-100
- 1×1ml TE緩沖液。在旋轉(zhuǎn)混合器上混合1分鐘。
依次使用上述緩沖液兩次洗滌磁珠。每次用吸頭抽吸3-8次，并在旋轉(zhuǎn)混合器上旋轉(zhuǎn)10分鐘。
2. 通過(guò)磁力架去除洗滌緩沖液并收集沉淀復(fù)合物。
3. 將沉淀復(fù)合物懸浮在100μl TE緩沖液中。添加3-5μl 10% SDS和5μl 20mg/ml蛋白酶K。在65℃下孵育過(guò)夜。
4. 第二天，短暫渦旋混合，并使用磁力架將上清液轉(zhuǎn)移到新的管中。
5. 用100μl TE緩沖液 + 0.5M NaCl洗滌磁珠。將其與步驟4中的上清液結(jié)合。
DNA純化
您可以根據(jù)說(shuō)明書用試劑盒提取DNA。
