免疫組化（IHC/ICC）方案

用途

對組織或細(xì)胞中的未知抗原進(jìn)行定性，定位或定量。

步驟（以石蠟切片為例）

1. 脫蠟和水合

去除切片中的石蠟，暴露組織。進(jìn)一步，恢復(fù)組織的水環(huán)境，以幫助檢測。

(1) 用二甲苯或環(huán)保脫蠟劑浸泡切片至少60分鐘，使組織脫蠟。在這道工序 之前，最好先加熱切片融化石蠟，這樣對去除石蠟會更有效。

(2) 將染色架依次置于100%、100%、95%、85%、75%、60%梯度酒精中，分別浸泡5min。

(3) 0.3% TritonX-100用于滲透細(xì)胞膜，有助于分子進(jìn)入靶細(xì)胞，5分鐘即可。

注意事項：

a. 全程保持切片各部位呈濕潤狀態(tài)，否則會有很高的背景。

b. 二甲苯有毒，可以用組織透明脫蠟劑代替。

c. 脫蠟前可對切片進(jìn)行加熱，以達(dá)到更好的脫蠟效果。

d. 通常使用2% APES- 丙酮緩沖液，通過將切片浸泡1min 并在60℃下加熱 15 min來防止切片上的組織剝離。

e. 脫蠟的時間因溫度和試劑的不同而有所不同。夏天，室溫比較高，可以適 當(dāng)縮短時間。此外，如果脫蠟劑已經(jīng)使用了一段時間，最好延長使用時間 或更換新的試劑。

2. 清除內(nèi)源性酶干擾和抗原修復(fù)

在固定過程中，甲醛可以與組織中的抗原交聯(lián)，阻斷抗原決定因子。因此，有必要打開抗原與甲醛的交聯(lián)效應(yīng)，以提高組織抗原的檢出率。有幾種方 法可以達(dá)到這一點，包括酶修復(fù)和熱修復(fù)。經(jīng)實驗驗證，熱修復(fù)效果優(yōu)于酶修復(fù)。此外，修復(fù)緩沖液也會影響抗原的恢復(fù)效果。有三種緩沖液的pH 值不同，包括檸檬酸緩沖液(pH 6.0),EDTA緩沖液(pH 8.0)和TE緩沖液(pH 9.0)。 一般pH值越高，修復(fù)力越強(qiáng)。內(nèi)源性酶，包括過氧化物酶和生物素，可與顯色底物DAB 和生物素標(biāo)記的二抗相互作用，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。所以我們需要去除內(nèi)源性酶。長期實驗證明，用ddH₂O或 PBS 或TBS 或甲醇稀釋3%H₂O₂，在10分鐘之內(nèi)可以很好地消除內(nèi)源酶的影響。

(1) 用3%H2O2去除內(nèi)源酶干擾5min。

(2) 于pH 值7.4的PBS 中浸泡切片。

(3) 在1L燒杯中準(zhǔn)備500ml 檸檬酸鈉緩沖液，并放入高壓鍋中。將帶墊圈的 緩沖液在水浴中加熱至100℃。然后，將染色架放置在煮熟的緩沖液中。燒杯口用保鮮膜密封，防止水蒸氣在加熱過程中進(jìn)入緩沖液。用 1000w 的電源繼續(xù)加熱至高壓狀態(tài)，保持2分鐘，然后立即停止加熱。

(4) 等到高壓鍋自然冷卻，開蓋取出燒杯，自然冷卻至室溫。

(5) PBS 分3次沖洗5分鐘。

3. 封閉

該過程是阻斷抗體與來自同一來源的二抗的血清的非特異性結(jié)合。用10%非免疫山羊血清阻塞組織，每片100μL,置于濕箱中室溫靜置30min。

4. 抗體解育

免疫組化實驗應(yīng)選擇經(jīng)驗證的一抗?？贵w的稀釋比和孵育時間應(yīng)根據(jù)實際情況進(jìn)行優(yōu)化。建議低溫和較長的孵育時間，以確?？贵w與抗原更好的結(jié)合。

(1) 除去封閉緩沖液。

(2) 將抗體稀釋至適當(dāng)濃度，加入組織中4℃解育過夜。我們推薦0.01μg/ml 作 為工作濃度。

(3) 用PBST 清洗切片3次，每次5 min。

(4) 按說明書稀釋二抗至工作濃度，37℃孵育1小時。我們選擇生物素標(biāo)記 抗體作為二抗。

(5) 用PBST 清洗切片3次，每次5 min。

(6) 第三個抗體按說明書稀釋至工作濃度，37℃孵育1h。

(7) 用PBST 清洗切片3次，每次5 min。

注意事項：

a. 為尋求最佳抗體孵育濃度，在正式實驗前應(yīng)通過設(shè)置梯度稀釋進(jìn)行初步實驗。

b. 建議抗體在低溫條件下孵育較長的時間，以確?？贵w和抗原的充分結(jié)合。 c.切片必須輕柔地清洗干凈，特別是在孵育不同抗體時。

5. 染色

這個過程中用到不同的檢測系統(tǒng)。 一種被標(biāo)記的一抗直接與底物反應(yīng)稱為 一步染色法。但是很貴。此外，還可以通過標(biāo)記二抗對目標(biāo)蛋白進(jìn)行染色， 放大檢測信號，稱為兩步法。還有一種三步法，標(biāo)記第三個抗體以獲得更好 的檢測信號放大。標(biāo)記基團(tuán)可以是HRP 或AP。 該基團(tuán)可以通過與不同底物 反應(yīng)而著色。DAB 是一種常見的染色底物。以下，我們執(zhí)行三步法，其中二 抗用生物素標(biāo)記，第三個抗體偶聯(lián)HRP。 最后，用蘇木精染色細(xì)胞核。

(1) 用PBS 中清洗切片2次，每次5 min。

(2) 配制新鮮的DAB, 使用前過濾。

(3) 在組織中加入DAB, 立即在顯微鏡下觀察染色情況。

(4) 當(dāng)組織有明顯染色時，必須及時在PBS 中清洗切片。

(5) 用蘇木精染色液染色細(xì)胞核，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)更清晰。

注意事項：

a. DAB 和蘇木精使用前應(yīng)過濾。

b. 使用前DAB 中應(yīng)加入新鮮的H₂O。

c. 在顯微鏡下觀察標(biāo)記基團(tuán)與底物的反應(yīng)，及時終止顯色時間，時間不超過10分鐘。

6. 檢測

(1) 將切片在60℃下加熱至干燥，然后加入適量中性香脂密封組織；

(2) 在顯微鏡下觀察染色，在合適的視野下拍照。

常見問題

1. 無染色

(1) 一抗和二抗不匹配，使用針對一抗的二抗(如一抗來自兔，二抗為抗兔 抗體)

(2) 沒有足夠的一抗與目標(biāo)蛋白結(jié)合，使用低稀釋度抗體。延長4℃孵育時 間(如過夜)。

(3) 抗體的天然結(jié)構(gòu)受損，不適用于IHC, 用天然(非變性的)WB 法檢測抗 體，確?？贵w沒被損壞。

(4) 由于儲存不當(dāng)、稀釋或反復(fù)凍融造成一抗/二抗試劑盒失效，做陽性對 照確認(rèn)一抗/二抗試劑盒的有效性。

(5) 靶組織中沒有目標(biāo)蛋白，參照抗體供應(yīng)商的建議做陽性對照。

(6) 組織中沒有足夠的目標(biāo)蛋白，應(yīng)用信號放大操作。

(7) 沒有避光保存二抗，避免將二抗處于光照下。

(8) 脫蠟不徹底，延長脫蠟時間，更換二甲苯。

(9) 固定步驟(使用福爾馬林和多聚甲醛固定劑)修飾了抗體識別表位，抗 原修復(fù)法暴露出抗原表位，縮短固定時間。

(10) 蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)(核蛋白),抗體不能穿透核膜,在封閉液和抗體稀 釋液中加入通透劑。

(11) PBS 緩沖液被細(xì)菌污染后破壞了靶蛋白的磷酸根在抗體PBS 儲存液 中加入0.01%疊氮化合物，或使用新鮮無菌的PBS。

2. 高背景

(1) 沒有封閉非特異性結(jié)合或封閉不充分，延長封閉時間，并考慮更換封閉劑。
建議用10%正常血清封閉切片1小時或1-5% BSA 封閉培養(yǎng)細(xì)胞30 分鐘。

(2) 一抗?jié)舛冗^高
滴定法尋找到最佳抗體濃度，或在濃度較低抗體中延長孵育時間(最 好是緩慢而準(zhǔn)確地結(jié)合)。

(3) 孵育溫度過高，4℃孵育切片或細(xì)胞

(4) 二抗發(fā)生了非特異性結(jié)合(被損壞),不加一抗，做二抗對照。

(5) 組織沖洗不徹底，有固定劑殘留，所有步驟都要用PBS 充分洗滌。

(6) 存在內(nèi)源性過氧化物酶活性，用酶抑制劑如抑制堿性磷酸酶的鹽酸左旋咪唑 (2mM)，或抑制過氧化物酶的H₂O₂ (0.3%v/v)。(詳見IH 操作手冊)。

(7) 固定過度(固定劑用福爾馬林和多聚甲醛)導(dǎo)致抗體識別抗原位點被 修飾，改變抗原修復(fù)方法，縮短與抗原修復(fù)液的孵育時間。

(8) 信號過度放大(信號放大技術(shù)),縮短信號放大孵育時間，稀釋信號擴(kuò) 大試劑盒。

(9) 底物過量(酶檢測法),縮短底物孵育時間

(10) 染料與PBS 在細(xì)胞/組織中相互作用(酶檢測法)
用Tris緩沖液沖洗切片后，再與底物孵育。孵育后，Tris緩沖液再次沖洗細(xì)胞/切片。

(11) 通透作用破壞膜并除去了膜蛋白，去除緩沖液中的通透劑。

3. 非特異性染色

(1) 一抗/二抗?jié)舛冗^高，降低抗體濃度和或縮短孵育周期。對比不表達(dá)目 標(biāo)蛋白細(xì)胞的信號強(qiáng)度。

(2) 存在內(nèi)源性過氧化物酶活性，用酶抑制劑如抑制堿性磷酸酶的鹽酸左旋咪唑 (2mM)，或抑制過氧化物酶的H₂O₂ (0.3% v/v)。(詳見IHC操作手冊)。

(3) 一抗與被染組織同源(如用鼠一抗測鼠組織),加二抗后，二抗會與同源 的所有組織結(jié)合，應(yīng)用與組織非同源的一抗。

(4) 切片/細(xì)胞變干，保持切片/細(xì)胞濕度，切勿變干。