Western Blotting（WB）實(shí)驗(yàn)流程

1. 蛋白質(zhì)樣品準(zhǔn)備

1.1 蛋白質(zhì)樣品來源

蛋白質(zhì)樣品可以是可溶性蛋白質(zhì)液體、細(xì)胞/組織裂解液或免疫沉淀的蛋白質(zhì)。不同樣品的蛋白質(zhì)加載量有所不同，一般來說，純化蛋白質(zhì)的推薦加載量不超過100 ng，細(xì)胞/組織裂解液的加載量可為10-40 μg。

1.2 蛋白質(zhì)樣品準(zhǔn)備

通常情況下，從動(dòng)物或植物組織或細(xì)胞中提取復(fù)雜的蛋白質(zhì)成分，提取過程中應(yīng)遵循以下原則：

a. 根據(jù)不同蛋白質(zhì)的特性選擇合適的提取方法。

b. 使用適當(dāng)?shù)姆椒ㄗ畲笙薅鹊靥崛∧繕?biāo)蛋白質(zhì)。

c. 在低溫下進(jìn)行操作，并添加蛋白酶抑制劑以防止蛋白質(zhì)降解。

d. 選擇適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)裂解液以保持蛋白質(zhì)的溶解性。

e. 將蛋白質(zhì)樣品儲(chǔ)存于-80℃，避免反復(fù)凍融，盡快進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 蛋白裂解物的選擇

對(duì)于大多數(shù)樣品，RIPA裂解緩沖液可用于快速細(xì)胞裂解。

表1. RIPA裂解緩沖液的組成

蛋白質(zhì)裂解液的主要成分及其作用如下：

具有一定pH范圍的緩沖液可以為蛋白質(zhì)提供穩(wěn)定的環(huán)境，并增加蛋白質(zhì)的溶解性。常用的是Tris-HCl或HEPES緩沖液，pH值在生理pH范圍內(nèi)。 Tris-HCl緩沖液（pKa = 8.1）的pH范圍為7.0-9.2，對(duì)溫度敏感。HEPES緩沖液（pKa = 7.55）的pH值范圍為6.5-8.5。

適當(dāng)?shù)柠}離子濃度可以維持蛋白質(zhì)的溶解性。選擇近似生理狀態(tài)下的150 mM NaCl不會(huì)影響蛋白質(zhì)的溶解和蛋白質(zhì)之間的相互作用。

螯合金屬離子用于防止蛋白質(zhì)提取物過于黏稠，降低溶解性。此外，螯合劑還可以與某些酶相互作用，抑制酶活性。

添加一定量的還原劑可以保護(hù)蛋白質(zhì)上的游離巰基免受氧化，從而避免蛋白質(zhì)聚集或變性。β-巰基乙醇和二硫蘇糖醇（DTT）是常用的還原劑，后者比前者更強(qiáng)大。通常，β-巰基乙醇具有揮發(fā)性，并且在加入緩沖液后會(huì)在短時(shí)間內(nèi)被氧化，從而可能影響蛋白質(zhì)的活性，其工作濃度為5-20 mM/L。DTT具有更強(qiáng)的還原能力，在氧化后可以形成穩(wěn)定的分子內(nèi)二硫鍵而不影響蛋白質(zhì)的巰基。其工作濃度為0.5-1 mM/L?；旧?，長期儲(chǔ)存建議使用DTT，但DTT溶液不穩(wěn)定，需在制備后立即使用。

表面活性劑是一種界面活性劑，其疏水段插入到膜的磷脂雙層中，改變其滲透性，最終破壞膜結(jié)構(gòu)。因此，表面活性劑的強(qiáng)度直接決定了裂解細(xì)胞的能力。裂解液中使用的表面活性劑主要分為兩類：陰離子表面活性劑和非離子表面活性劑。常用的表面活性劑如下：

SDS：陰離子表面活性劑，具有很強(qiáng)的破壞力，基本上可以溶解所有蛋白質(zhì)，并破壞其天然構(gòu)象結(jié)構(gòu)。SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合比例為1.4：1，可以有效覆蓋蛋白質(zhì)本身的電荷。SDS的臨界膠束溫度稍高，因此在低溫下可能出現(xiàn)沉淀，并且在存在鉀鹽的情況下沉淀會(huì)更明顯。此外，溶液的離子強(qiáng)度越強(qiáng)，離子性表面活性劑的臨界膠束濃度越低，使蛋白質(zhì)更易溶解。

NaDOC：一種離子性表面活性劑，比SDS弱一些。

Triton X-100：一種非離子表面活性劑。它可以破壞蛋白質(zhì)與脂質(zhì)之間的相互作用，但不會(huì)使蛋白質(zhì)變性，也不會(huì)破壞蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的連接。它可以保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。它的臨界膠束濃度較低，可以在64℃時(shí)觀察到兩相分離現(xiàn)象。

NP-40：一種非離子表面活性劑，對(duì)細(xì)胞核膜的破壞較弱，但對(duì)蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，可以保證蛋白質(zhì)的溶解度和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，因此特別適用于在非變性條件下溶解膜蛋白質(zhì)。

Tween 20：一種溫和的非離子表面活性劑，對(duì)蛋白質(zhì)的溶解能力較差，不會(huì)破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，不是蛋白質(zhì)裂解液的常見成分。

選擇表面活性劑取決于要提取的蛋白質(zhì)的性質(zhì)和實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。選擇表面活性劑時(shí)需要考慮許多因素，包括充分裂解細(xì)胞和溶解蛋白質(zhì)，以及提取蛋白質(zhì)的狀態(tài)（變性或保持天然狀態(tài)）。

在蛋白質(zhì)提取過程中，細(xì)胞和組織的破壞會(huì)釋放大量的蛋白酶。為了抑制蛋白酶活性，樣品必須保持在低溫下，并加入適量的蛋白酶抑制劑以防止目標(biāo)蛋白質(zhì)的降解。

表2. 常用的蛋白酶抑制劑

2. 蛋白質(zhì)定量

為了定量樣品中感興趣的蛋白質(zhì)，需要確定樣品中總蛋白質(zhì)的含量。當(dāng)總蛋白質(zhì)的含量保持恒定時(shí)，目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的差異就會(huì)體現(xiàn)出來。

表3. 常用的化學(xué)定量方法

2.1 用Bradford方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

a. 準(zhǔn)備牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品：
將0.05克BSA溶解在5毫升PBS中，得到10毫克/毫升的BSA標(biāo)準(zhǔn)品。

b. 準(zhǔn)備庫馬司亮藍(lán)G-250染色液：
將50毫克庫馬司亮藍(lán)G-250溶解在25毫升90%乙醇中，加入50毫升磷酸（85%），用純水稀釋至500毫升。避光保存。

c. 稀釋蛋白樣品：
對(duì)蛋白樣品進(jìn)行1:10、1:20和1:40的稀釋。

d. 將BSA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至以下濃度。

	1	2	3	4	5	6	7	8
濃度（mg/mL）	0	0.05	0.075	0.1	0.15	0.2	0.3	0.4

e. 將稀釋后的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液和蛋白樣品各加入微孔板條的孔中，每孔加入20 μL，然后加入180 μL G250染色溶液，并充分混合。

f. 使用分光光度計(jì)在595 nm波長下測(cè)量吸光度，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線以計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。

2.2 BCA法（請(qǐng)參考相應(yīng)試劑盒的說明）

a. 準(zhǔn)備牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品：

a. 將BCA試劑A與試劑B按50:1（體積比）的比例混合制備BCA工作試劑，并在室溫下孵育24小時(shí)。

b. 將標(biāo)準(zhǔn)品溶解至與樣品使用的相同溶劑相同濃度的0.5 mg/L。

c. 逐漸加入梯度體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液（0 μL，1 μL，2 μL，4 μL，8 μL，12 μL，16 μL，20 μL）到微孔板孔中，并向每個(gè)孔中加入標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，使最終體積為20 μL。

d. 向每個(gè)孔中加入200 μL BCA工作試劑，并在37℃下孵育30分鐘。

e. 使用分光光度計(jì)在562 nm波長下測(cè)量吸光度。

f. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。

3. 蛋白樣品制備

蛋白質(zhì)的變性涉及破壞蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)并暴露抗原表位，有助于抗體與目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)合和后續(xù)檢測(cè)。為了變性蛋白質(zhì)，將蛋白樣品與2倍的樣品加載緩沖液按體積比1:1或6倍的樣品加載緩沖液按體積比5:1混合，將混合溶液在95℃下煮沸5分鐘。

膜蛋白在高溫下往往會(huì)聚集和沉淀，應(yīng)在37℃下處理30分鐘。

表4. 加載緩沖器組件

4. SDS-PAGE

4.1 SDS-PAGE凝膠

聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺的聚合形成的，這導(dǎo)致形成具有分子篩性質(zhì)的凝膠結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)。蛋白質(zhì)被大量帶有負(fù)電荷的SDS膠束包裹，覆蓋了蛋白質(zhì)本身的電荷，并為蛋白質(zhì)提供了均勻的電荷質(zhì)量比。SDS-PAGE的分辨率與丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺交聯(lián)劑的濃度相關(guān)。不同濃度交聯(lián)劑形成的分子篩具有不同的孔徑，根據(jù)分子量可以提供各種不同的分離條件（詳見下文）。

表5. 凝膠百分比和相應(yīng)的蛋白質(zhì)大小

表6. 丙烯酰胺凝膠的組成與功能

4.2 電泳緩沖液制備

常規(guī)的SDS-PAGE是一種用于分離分子量在30 kDa到250 kDa之間的蛋白質(zhì)的強(qiáng)大工具。根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x凝膠濃度（見表5）。

表7. 電泳緩沖液(1L)組分

在甘氨酸-三氨基甲烷凝膠電泳系統(tǒng)中，使用恒定功率，將濃縮凝膠以60-80 V運(yùn)行，分離凝膠以100-120 V運(yùn)行。電壓越低，運(yùn)行速度越慢，可以獲得更好的分離效果。

然而，常規(guī)的甘氨酸-三氨基甲烷凝膠系統(tǒng)對(duì)于分離分子量較小（<30 kDa）的小分子蛋白質(zhì)的分辨率不高。三甘氨酸的電子遷移率和解離常數(shù)優(yōu)于甘氨酸，這在濃縮凝膠中為小分子蛋白質(zhì)提供了更好的濃縮效應(yīng)，在分離凝膠中獲得更高的分辨率。

表8. 推薦的電泳緩沖液用于小分子蛋白質(zhì)

我們建議在三甘氨酸-三氨基甲烷凝膠中以恒定電壓（60-100 V）進(jìn)行電泳。

4.3 蛋白質(zhì)標(biāo)記物和負(fù)載對(duì)照

根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，使用適當(dāng)?shù)膶?duì)照非常重要。

分子量指示劑：覆蓋適當(dāng)范圍分子量的蛋白質(zhì)標(biāo)記物可以指示蛋白質(zhì)的分子量，并在一定程度上反映電泳效果和膜轉(zhuǎn)移效率。根據(jù)不同特點(diǎn)，常用的標(biāo)記物大致可分為三類：未染色標(biāo)記物、預(yù)染色標(biāo)記物和顯影標(biāo)記物。

表9. 不同蛋白標(biāo)記物的比較

這解釋了為什么在免疫印跡中觀察到的帶狀大小與預(yù)測(cè)的大小不同。為了盡量減少預(yù)染色標(biāo)記物引起的分子量偏移的影響，可以將其與未染色標(biāo)記物進(jìn)行對(duì)比，以確定目標(biāo)帶的準(zhǔn)確分子量大小（下圖左側(cè)顯示了預(yù)染色標(biāo)記物和未染色標(biāo)記物之間的差異）。此外，不同廠家的蛋白質(zhì)標(biāo)記物差異很大，客戶在選擇蛋白質(zhì)標(biāo)記物時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎（下圖右側(cè)顯示了不同廠家的預(yù)染色標(biāo)記物之間的差異）。在確定免疫印跡結(jié)果中的蛋白質(zhì)時(shí)，應(yīng)考慮到預(yù)染色標(biāo)記物引起的分子量偏移。

陽性對(duì)照：可以使用表達(dá)感興趣蛋白質(zhì)的細(xì)胞系組織或細(xì)胞裂解液作為陽性對(duì)照。

負(fù)載對(duì)照：在各種組織和細(xì)胞中，由 housekeeping 基因編碼的蛋白質(zhì)水平相對(duì)恒定，這種蛋白質(zhì)可以在定量感興趣蛋白質(zhì)時(shí)作為負(fù)載對(duì)照，以確保每條凝膠槽中加載相同數(shù)量的蛋白質(zhì)。此外，負(fù)載對(duì)照蛋白質(zhì)還可用于評(píng)估實(shí)驗(yàn)是否運(yùn)行成功。

常見的內(nèi)部參考基因（housekeeping gene）：根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的，在研究不同蛋白質(zhì)時(shí)選擇正確的負(fù)載對(duì)照蛋白質(zhì)非常重要。

選擇負(fù)載對(duì)照蛋白質(zhì)時(shí)應(yīng)考慮以下因素：

表10. 基因在細(xì)胞的不同位置

a. 某些常規(guī)基因的表達(dá)水平可能會(huì)受到某些實(shí)驗(yàn)條件的影響，如外界刺激或藥物處理。在選擇負(fù)載對(duì)照蛋白質(zhì)時(shí)，重要的是參考相關(guān)文獻(xiàn)并驗(yàn)證其在樣本中的表達(dá)是否恒定，且不受某些實(shí)驗(yàn)條件的影響。

b. 感興趣蛋白質(zhì)的分子量應(yīng)與負(fù)載對(duì)照蛋白質(zhì)的分子量有所區(qū)別，以便進(jìn)行清晰的檢測(cè)和區(qū)分。如果負(fù)載對(duì)照蛋白質(zhì)與感興趣蛋白質(zhì)具有相似的分子量，在可視化感興趣蛋白質(zhì)的帶狀條之后，使用主/次抗體去除液洗去抗體，然后再進(jìn)行負(fù)載對(duì)照抗體的孵育和負(fù)載對(duì)照蛋白質(zhì)的可視化。

4.4 凝膠電泳

a. 快速離心樣品以去除雜質(zhì)，建議將10-30 μg總蛋白質(zhì)加載到凝膠槽中。純化蛋白質(zhì)的推薦負(fù)載量為10-100 ng。根據(jù)結(jié)果需要調(diào)整負(fù)載量。

b. 在一個(gè)槽中加入分子量標(biāo)記物以指示感興趣蛋白質(zhì)。

c. 使用恒定電壓進(jìn)行電泳（電壓設(shè)定為120 V或更低）。為了獲得更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在全蛋白質(zhì)在濃縮凝膠中遷移時(shí)，建議使用80 V。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遷移到分離凝膠時(shí)，應(yīng)提高電壓。

d. 通常的電泳時(shí)間約為1.2小時(shí)。然而，分子量小于20 kDa的蛋白質(zhì)應(yīng)根據(jù)感興趣的蛋白質(zhì)縮短電泳時(shí)間。而大于100 kDa的蛋白質(zhì)，應(yīng)延長電泳時(shí)間以獲得更好的蛋白質(zhì)分離效果。

5. 轉(zhuǎn)印

5.1 轉(zhuǎn)印方法

將分離的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相介質(zhì)，通常使用濕式轉(zhuǎn)印和半干式轉(zhuǎn)印方法。這兩種轉(zhuǎn)印方法在原理上是相同的，只是施加電場(chǎng)的機(jī)械裝置和固定凝膠和膜的方法不同，半干式轉(zhuǎn)印使用浸潤有緩沖溶液的多層濾紙。

表11. 轉(zhuǎn)移方式類型的比較

在轉(zhuǎn)印膜時(shí)，高電流下裝置在短時(shí)間內(nèi)會(huì)迅速產(chǎn)生熱量。因此，在轉(zhuǎn)印膜時(shí)需要采取措施保持低溫條件。在槽式轉(zhuǎn)印中，可以用冰水浸泡裝置進(jìn)行散熱，而在半干式轉(zhuǎn)印中，不適宜進(jìn)行長時(shí)間的電流通，因此我們建議在高分子量蛋白質(zhì)（100 kDa以上）的情況下使用槽式轉(zhuǎn)印。

對(duì)于低分子量和中分子量蛋白質(zhì)，半干式轉(zhuǎn)印和槽式轉(zhuǎn)印的效果幾乎相同。

5.2 膜的選擇

硝酸纖維素（NC）和聚偏氟乙烯（PVDF）是最常用的轉(zhuǎn)印膜。

表12. NC膜與PVDF膜的比較

膜的結(jié)合能力主要與其純度有關(guān)，純度越高，蛋白質(zhì)的結(jié)合能力就越強(qiáng)。然而，高純度的硝酸纖維素膜易碎且容易破裂。與硝酸纖維素膜相比，聚偏氟乙烯（PVDF）膜不僅具有更強(qiáng)的蛋白質(zhì)結(jié)合能力，還具有更好的化學(xué)抗性。

請(qǐng)注意，在使用聚偏氟乙烯膜之前，應(yīng)用甲醇浸泡（>15秒）激活膜上的正電荷基團(tuán)，并在膜緩沖液中平衡一段時(shí)間。此外，PVDF膜和硝酸纖維素膜具有不同的孔徑。

對(duì)于小分子蛋白質(zhì)（<20 kDa），我們建議采用0.22 μm的孔徑膜，以避免超過轉(zhuǎn)移的限制。

對(duì)于大多數(shù)情況，建議使用0.45 μm的孔徑膜。

5.3 蛋白質(zhì)分離和膜轉(zhuǎn)印條件優(yōu)化

● 關(guān)于小分子蛋白質(zhì)的膜轉(zhuǎn)印，我們可以基于以下幾個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化：

a. 增加交聯(lián)劑的濃度，并使用15%丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。然而，針對(duì)15 kDa以下的蛋白質(zhì)，15%丙烯酰胺凝膠的分辨率較低，因此我們建議在堆積凝膠和分離凝膠之間添加10%的中間層凝膠，以增加小分子蛋白質(zhì)的分辨率。

b. 將Tris-Glycine緩沖系統(tǒng)替換為Tris-Tricine電泳系統(tǒng)，以獲得更好的濃縮和分離效果。請(qǐng)注意，在使用Tris-Tricine時(shí)，電壓應(yīng)適中，60 V-80 V為宜。

c. 選擇0.22 μm的孔徑膜。

d. 縮短膜轉(zhuǎn)印時(shí)間。

● 關(guān)于大分子蛋白質(zhì)的膜轉(zhuǎn)印，我們可以基于以下幾個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化：

a. 降低交聯(lián)劑的濃度，使用8%-5%丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。請(qǐng)注意，凝膠濃度越低，膜越脆弱，請(qǐng)?jiān)诓僮鲿r(shí)小心處理。

b. 在轉(zhuǎn)印過程中，適當(dāng)提高電流，延長膜轉(zhuǎn)印時(shí)間，避免產(chǎn)生熱量。建議在4℃溫度下進(jìn)行長時(shí)間（過夜）的槽式轉(zhuǎn)印。

c. 減少轉(zhuǎn)印緩沖液中的甲醇含量有助于將SDS分子與蛋白質(zhì)分離。高濃度甲醇固定蛋白質(zhì)對(duì)大分子蛋白質(zhì)不利，建議將甲醇濃度降低到10%。

5.4 轉(zhuǎn)印效率監(jiān)測(cè)

a. 預(yù)染標(biāo)記物的轉(zhuǎn)印結(jié)果反映了蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)印效率。

b. 使用朋酮染色劑染色，從染色的帶狀條判斷轉(zhuǎn)印是否成功。這個(gè)過程是可逆的，但不適用于尼龍膜。

朋酮染色溶液制備：將5%（體積/體積）乙酸，0.1%（質(zhì)量/體積）朋酮溶解在純水中，存放在4℃。

朋酮染色過程：

- 將轉(zhuǎn)印后的PVDF或NC膜浸泡在朋酮染色溶液中，搖擺5-10分鐘。

- 取出膜，用PBS洗滌3次×5分鐘。

- 觀察染色的紅色條帶并記錄轉(zhuǎn)印結(jié)果。

- 再次用PBS洗滌3次×5分鐘以去除結(jié)合的朋酮，以便進(jìn)行進(jìn)一步的Western blot分析。

c. 使用柯曼藍(lán)染色溶液染色，這個(gè)過程是不可逆的，但柯曼藍(lán)染色溶液的靈敏度高于朋酮染色溶液。

柯曼藍(lán)染色溶液制備：加入10%（體積/體積）冰醋酸、45%（體積/體積）甲醇、0.25%（質(zhì)量/體積）柯曼藍(lán)，純水混合均勻。

柯曼藍(lán)染色去染溶液制備：加入25%（體積/體積）甲醇、8%（體積/體積）冰醋酸，純水混合均勻。

柯曼藍(lán)染色過程：

- 將轉(zhuǎn)印后的PVDF和NC膜浸泡在柯曼藍(lán)染色溶液中，用搖床在室溫下緩慢搖動(dòng)1小時(shí)（根據(jù)凝膠的尺寸、厚度和溫度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整），直到凝膠變藍(lán)。

- 倒掉染色溶液，將凝膠浸泡在去染溶液中，在室溫下用搖床緩慢搖動(dòng)4小時(shí)，直到藍(lán)色背景去染，蛋白質(zhì)條帶可見。

5.5 轉(zhuǎn)印緩沖液的制備

制備1L轉(zhuǎn)印緩沖液如下：

表13. 1L傳輸緩沖器的組件

轉(zhuǎn)印緩沖液需要避光儲(chǔ)存，可以重復(fù)使用。

然而，由于甲醇具有揮發(fā)性，需要及時(shí)更換新鮮的轉(zhuǎn)印緩沖液。

5.6 轉(zhuǎn)印

a. 小心分離分離凝膠。

b. 使用濾紙-凝膠-濾紙制作“三明治”，保持“三明治”濕潤并避免氣泡。制備“三明治”的步驟如下：

c. 根據(jù)制造商的說明書組裝轉(zhuǎn)印裝置。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或PVDF膜上。對(duì)于分子量低于20 kDa的蛋白質(zhì)，推薦使用0.22 μm的膜。

d. 根據(jù)實(shí)際情況，通常有兩種選擇的轉(zhuǎn)印裝置，濕式轉(zhuǎn)印和半干式轉(zhuǎn)印。濕式轉(zhuǎn)印和半干式轉(zhuǎn)印對(duì)于常規(guī)大小的蛋白質(zhì)（20-100 kDa）都可以很好地工作，但由于半干式轉(zhuǎn)印可能產(chǎn)生更高的背景染色，濕式轉(zhuǎn)印更適用于高分子量蛋白質(zhì)。

e. 用PBS緩沖液沖洗印跡約5分鐘。

6. 阻斷

使用阻斷緩沖液在室溫下阻斷膜1小時(shí)。

選擇阻斷緩沖液

結(jié)合表面不平整，有許多小孔。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被轉(zhuǎn)移到結(jié)合表面時(shí)，通過相互作用吸附到結(jié)合表面。然而，并不是所有的位點(diǎn)都被蛋白質(zhì)吸附，因此需要阻斷緩沖液吸附到剩余的結(jié)合位點(diǎn)，以防止抗體分子直接吸附到膜上導(dǎo)致偽陽性或高背景結(jié)果。

選擇阻斷緩沖液的原則應(yīng)該是：

a. 阻斷緩沖液能夠阻斷結(jié)合膜上所有未結(jié)合的位點(diǎn)。

b. 阻斷緩沖液不干擾目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)合。它不與目標(biāo)蛋白質(zhì)的表位結(jié)合，也不與其他試劑發(fā)生交叉反應(yīng)。

以下是常用阻斷緩沖液的具體細(xì)節(jié)：

表14. 各種阻塞緩沖區(qū)的比較

不同阻塞緩沖區(qū)的對(duì)比實(shí)驗(yàn)如下:

7. 一抗孵育

按照產(chǎn)品說明書稀釋一抗，通常一抗稀釋緩沖液的成分與阻斷緩沖液相同。此外，我們建議選擇經(jīng)過驗(yàn)證的一抗，并將一抗在4℃下孵育過夜，以確?？乖涂贵w充分結(jié)合。

我們建議進(jìn)行梯度初步實(shí)驗(yàn)來確定一抗的最佳稀釋比例，例如點(diǎn)印法。

a. 依次將不同加載量的樣品加載到NC膜上，自然風(fēng)干。

b. 樣品完全吸附后，阻斷膜。

c. 根據(jù)加載梯度切割膜。

d. 分別使用不同濃度梯度的一抗和二抗孵育。

e. 最后，采用ECL發(fā)光底物孵育和顯影，根據(jù)顯影結(jié)果初步確定稀釋比例范圍。

8. 二抗孵育

8.1 實(shí)驗(yàn)操作

a. 在二抗孵育前，用PBST/TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。

b. 適當(dāng)稀釋二抗，在室溫下孵育1小時(shí)。

c. 二抗孵育結(jié)束后，用PBST/TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的二抗。

8.2 二抗選擇

● 物種來源

我們不建議選擇兔、大鼠或小鼠物種的二抗，因?yàn)樗鼈兣c人類物種的同源性較高，容易發(fā)生交叉反應(yīng)，從而導(dǎo)致高背景。常用的二抗物種來源是山羊或驢，但請(qǐng)注意，所選二抗的物種來源必須與所選一抗的物種來源不同，二抗的物種來源選擇取決于一抗的物種。

此外，如果使用的是單克隆一抗，則還需要注意亞型，并選擇針對(duì)一抗亞型的二抗。

● 純化方法

主要的純化方法有蛋白G/A純化和抗原親和純化。

蛋白G/A純化方法結(jié)合了血清中所有抗體IgG分子，沒有抗原特異性區(qū)分。

親和純化是一種通過與抗體特異識(shí)別的配體或受體結(jié)合來洗脫的方法。通過這種方法可以純化血清中的特定抗體成分。因此，具有抗原親和純化方法的二抗會(huì)降低非特異性結(jié)合并提高檢測(cè)蛋白的特異性。

● 適合的共軛

在Western Blot驗(yàn)證中，最常用的二抗共軛是辣根過氧化物酶（HRP）共軛，如辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）。

常用作底物的HRP具有高特異性、穩(wěn)定、快速和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。雖然AP更為敏感，但背景通常較高，并且可能存在于實(shí)驗(yàn)樣品中的內(nèi)源性磷酸酶可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾。

此外，如果使用AP共軛的二抗，請(qǐng)注意選擇合適的阻斷緩沖液，以避免磷酸酶的干擾。

9. 圖像顯現(xiàn)

● 化學(xué)發(fā)光顯現(xiàn)

Luminol是最經(jīng)典的辣根過氧化物酶（HRP）化學(xué)發(fā)光底物之一，在H2O2存在下與辣根過氧化物酶發(fā)生酶催化反應(yīng)，具有高靈敏度和良好的成像特性，可以在膠片上顯現(xiàn)。

● 底物顯現(xiàn)

有許多種HRP染色底物，最常用的是DAB。它通過與HRP反應(yīng)形成不溶性棕色沉淀物來顯現(xiàn)，同時(shí)具有高靈敏度。

然而，它需要在點(diǎn)滴上使用，并且具有致癌性，請(qǐng)?jiān)诓僮鲿r(shí)注意安全。

● 熒光顯現(xiàn)

通過使用適當(dāng)?shù)臒晒舛?，可以?shí)現(xiàn)熒光二抗顯現(xiàn)，彌補(bǔ)了化學(xué)發(fā)光和底物顯現(xiàn)在定量上的不足。

10. 常見問題

10.1 背景高

10.2 無目標(biāo)波段

10.3 觀測(cè)波段大小與預(yù)測(cè)波段大小不匹配

10.4 其他問題