如何選擇合適的二抗

1. 一抗的宿主物種是什么?

眾所周知，一抗從何而來(lái)，而相應(yīng)的二抗也是一種針對(duì)該物種的抗體。換句話(huà)說(shuō)，二抗是直接針對(duì)宿主的一抗。因此，你需要一種二抗，這種二抗與一抗的宿主物種不同，以避免物種反應(yīng)性。例如，如果您的一抗是小鼠來(lái)源的單克隆抗體，則二抗被選擇為抗小鼠二抗(山羊抗小鼠或兔抗小鼠)。如果一抗是由兔血清制備的兔源性多克隆抗體，則相應(yīng)的二抗需要選擇一種針對(duì)兔的二抗。即根據(jù)一抗的種類(lèi)來(lái)源，選擇相應(yīng)的針對(duì)該物種的二抗。

2. 一抗的類(lèi)別(同型)和/或亞類(lèi)別是什么?

二抗除與一抗的種源一致外，還需與一抗的類(lèi)或亞類(lèi)相匹配，尤其是與單克隆抗體協(xié)同工作時(shí)。而多克隆抗體主要是典型的IgG或IgG樣類(lèi)免疫球蛋白，因此相應(yīng)的二抗是抗IgG抗體。

與多克隆抗體相比，單克隆抗體更為復(fù)雜。由于單克隆抗體有不同的類(lèi)別和亞型，相應(yīng)的二抗也需要根據(jù)這些亞型來(lái)選擇。它們最常見(jiàn)于小鼠，偶爾見(jiàn)于大鼠、倉(cāng)鼠或兔子。例如，如果一抗單克隆抗體是小鼠IgM，則所需的二抗應(yīng)該是抗小鼠IgM。

如果單克隆一抗是小鼠IgG亞類(lèi)(IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)中的一種，那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結(jié)合，也可以選擇靶向這一亞類(lèi)。但如果一抗的亞類(lèi)不知道，那么你可以選擇抗小鼠IgG F(ab)二抗，它具有識(shí)別大多數(shù)小鼠免疫球蛋白亞類(lèi)的能力。在這里，我們整理了免疫球蛋白的類(lèi)別和子類(lèi)如下:

• 免疫球蛋白類(lèi)：IgG, IgM, IgA, IgE, IgD
• 人免疫球蛋白亞類(lèi)：IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1和IgA2
• 小鼠免疫球蛋白亞類(lèi)：IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3
• 輕鏈：Kappa, Lambda
• 重鏈：IgG (γ)， IgM (mu)， IgA (α)， IgD (δ)， IgE (ε)

當(dāng)你讀到這里，你可能會(huì)覺(jué)得選擇一個(gè)正確的二級(jí)是非常困難的，存在許多類(lèi)和子類(lèi)的人類(lèi)和小鼠IgG(s)。是的，我同意你的觀點(diǎn)。如果想獲得更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，就應(yīng)該反復(fù)這樣做。

注意：這些IgG的一個(gè)共同因子是輕鏈(κ和λ)。換句話(huà)說(shuō)，IgG, IgM, IgA, IgD和IgE都有κ或λ輕鏈。然而，重鏈?zhǔn)翘囟ㄓ陬?lèi)的。

3. 二抗的種類(lèi)是什么?

一般來(lái)說(shuō)，沒(méi)有證據(jù)表明二抗的質(zhì)量存在物種特異性的差異，也就是說(shuō)，在一般的實(shí)驗(yàn)中，山羊產(chǎn)生的二抗與驢產(chǎn)生的二抗沒(méi)有太大的區(qū)別。因此，宿主物種的選擇應(yīng)基于其他標(biāo)準(zhǔn)。

但在一些特殊的實(shí)驗(yàn)中，如雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)中，如果一抗中的一抗是山羊源的，而另一抗是小鼠源的，則相應(yīng)的二抗分別對(duì)山羊和抗小鼠的二抗具有抗性。二抗不能從山羊或小鼠來(lái)源中選擇。雙標(biāo)記的兩種是耐藥的，所以需要選擇第三種抗體來(lái)源。

4. 我需要預(yù)吸附的二抗嗎?

預(yù)吸附抗體又稱(chēng)交叉吸附抗體，是一種經(jīng)過(guò)處理以消除不需要的免疫球蛋白、抗體片段和/或細(xì)胞和組織樣本的反應(yīng)性，從而提高抗體特異性的抗體。建議使用一種二抗，它預(yù)先吸附到你正在檢測(cè)的物種。在這里，我們?yōu)槟懔信e了兩種情況，當(dāng)你必須選擇一個(gè)預(yù)吸附的二抗。

選擇預(yù)吸附抗體，當(dāng)免疫印跡組織和細(xì)胞也有高水平的免疫球蛋白。預(yù)吸附的二抗與內(nèi)源性免疫球蛋白相互作用的可能性較小，從而可能減少非特異性背景。

如果你在同一試驗(yàn)中使用了兩種不同的二抗(多重標(biāo)記)，你要確保任何一種二抗都不能相互識(shí)別。

5. 我應(yīng)該選擇什么樣的標(biāo)簽?

一般情況下，二抗可以是酶標(biāo)記(辣根過(guò)氧化物酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP, PAP)，熒光標(biāo)記(FITC, Alexa-Fluor, Qdot)或生物素偶聯(lián)。選擇標(biāo)記的二抗主要取決于特定的實(shí)驗(yàn)。

對(duì)于western blot和ELISA，最常用的二抗是酶標(biāo)二抗，而熒光標(biāo)記二抗通常用于細(xì)胞或組織標(biāo)記實(shí)驗(yàn)(細(xì)胞免疫化學(xué)、組織免疫化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù))。辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗也可用于治療。

如果要將檢測(cè)信號(hào)放大到更大的程度，可以使用生物素/親和素檢測(cè)系統(tǒng)。在一些熒光檢測(cè)方案中，需要選擇不同的熒光標(biāo)記;而金顆粒標(biāo)記的二抗則更常用于免疫電鏡檢查。

6. 我應(yīng)該使用親和純化抗體還是IgG部分?

親和純化抗體是通過(guò)固相親和層析從其他抗血清蛋白和非特異性免疫球蛋白中分離出單特異性抗體。近年來(lái)，親和純化抗體因其特異性強(qiáng)、低背景、靈敏度高、批間一致性好等特點(diǎn)而廣泛流行。

然而，使用親和純化抗體或IgG部分的優(yōu)勢(shì)將取決于預(yù)期的結(jié)合類(lèi)型。在某些情況下，純化過(guò)程中丟失的IgG部分也被考慮在內(nèi)，因?yàn)樗懈哂H和力的抗體，特別是當(dāng)感興趣的抗原量較小時(shí)，高親和力的IgG部分尤為重要。一般來(lái)說(shuō)，IgG組分可用于濁度測(cè)定。大多數(shù)其他免疫測(cè)定應(yīng)使用親和純化抗體。如果你不確定，選擇一種經(jīng)過(guò)親和純化的第二抗體。

7. 什么時(shí)候需要F(ab)或F(ab')2片段抗體?

F(ab')2片段:該抗體由兩個(gè)Fab片段通過(guò)二硫鍵結(jié)合抗原組成。在實(shí)驗(yàn)設(shè)置中，酶胃蛋白酶在鉸鏈區(qū)域下方裂解，因此形成了F(ab')2片段和pFc'片段。這些抗體用于特定情況，例如需要避免攜帶Fc受體的抗體和細(xì)胞。

Fab片段:抗原結(jié)合(Fab)片段是抗體上與抗原結(jié)合的區(qū)域。它由重鏈和輕鏈各一個(gè)常數(shù)域和一個(gè)可變域組成?？勺兘Y(jié)構(gòu)域包含抗原結(jié)合位點(diǎn)，在單體的氨基端包含一組互補(bǔ)決定區(qū)。只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)并通常用于阻斷內(nèi)源性免疫球蛋白類(lèi)。在實(shí)驗(yàn)條件下，木瓜蛋白酶可用于將免疫球蛋白單體裂解為兩個(gè)Fab片段和一個(gè)Fc片段。

F(ab')2抗體片段用于Fc區(qū)可能引起問(wèn)題的檢測(cè)系統(tǒng)。淋巴結(jié)、脾臟和外周血制劑等樣本含有帶有Fc受體的細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞)，這些細(xì)胞可與完整抗體的Fc區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致高本底染色。使用F(ab')2片段確保觀察到的任何抗體結(jié)合都不是由于Fc受體。