流式細(xì)胞術(shù)（FC）方案
原理
流式細(xì)胞術(shù)是一種高效的細(xì)胞分析技術(shù)，它可以對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分析和分類。該技術(shù)的原理是將細(xì)胞懸浮在液體中，通過流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)和分析。
流式細(xì)胞儀是一種高科技儀器，它可以將細(xì)胞懸浮液通過微細(xì)管道引入儀器中，然后通過激光束對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。激光束照射到細(xì)胞上時(shí)，會(huì)產(chǎn)生散射光和熒光信號(hào)。這些信號(hào)可以被流式細(xì)胞儀捕捉并記錄下來。流式細(xì)胞術(shù)的原理是基于細(xì)胞的特性進(jìn)行分類和分析。細(xì)胞的特性包括大小、形狀、表面分子、細(xì)胞器、染色體等。通過對(duì)這些特性的分析，可以對(duì)細(xì)胞 進(jìn)行分類和鑒定。
流式細(xì)胞術(shù)可以用于許多不同的應(yīng)用，包括細(xì)胞分析、細(xì)胞排序、細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞增殖等。例如，在癌癥研究中，流式細(xì)胞術(shù)可以用于檢測(cè)癌細(xì)胞的數(shù)量和類型，以及評(píng)估治療效果。在免疫學(xué)研究中，流式細(xì)胞術(shù)可以用于檢 測(cè)免疫細(xì)胞的數(shù)量和功能。
流式細(xì)胞術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是快速、準(zhǔn)確、高通量和高靈敏度。它可以對(duì)大量的細(xì)胞進(jìn)行分析，并且可以檢測(cè)到非常低濃度的細(xì)胞。此外，流式細(xì)胞術(shù)還可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，即同時(shí)檢測(cè)多個(gè)細(xì)胞特性。
用途
通過對(duì)細(xì)胞的特性進(jìn)行分析和分類，可以更好地理解細(xì)胞的功能和疾病的發(fā)生機(jī)制。
步驟
1. 樣品準(zhǔn)備
● 細(xì)胞樣品的制備
(1) 對(duì)于懸浮細(xì)胞，以1000rmp 離心收集細(xì)胞；對(duì)于貼壁細(xì)胞，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，并1000rmp 離心收集貼壁細(xì)胞。細(xì)胞密度需達(dá)到1*106。
(2) 用預(yù)冷的PBS 沖洗細(xì)胞3次；
● 組織樣品的制備
(1) 通過胰酶或膠原酶剪切組織和消化組織腫塊。
(2) 在顯微鏡下觀察單個(gè)分散細(xì)胞并終止消化。胰酶通常用于消化間質(zhì)較 少的組織，而膠原酶則用于有膠原結(jié)構(gòu)的組織。 一般胰酶作用時(shí)間為 20-60min, 而膠原酶作用時(shí)間為4-48h。
2. 固定和滲透作用
樣品的固定和滲透過程是決定實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵。交聯(lián)劑(如4%甲醛、 10%福爾馬林和戊二醛)和變性劑(如70%乙醇和90%乙醇)常被用作固定劑。交聯(lián)試劑與細(xì)胞蛋白交聯(lián)，變性試劑與膜反應(yīng)并破膜。因此，如果使用變性試劑進(jìn)行固定，則不需要對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白進(jìn)行滲透標(biāo)記。但必須將0.2% TritonX-100 交聯(lián)試劑固定在標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi)蛋白上進(jìn)行滲透。如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白，則不需要滲透。
(1)70%乙醇4℃固定12h(-20℃ 保存1個(gè)月)或4%甲醛室溫固定15min, 0.2% TritonX-100滲透5min(4℃ 保存1周)。如果目標(biāo)蛋白位于膜上，則 可以忽略其固定。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，需要固定。
(2)1000rpm 離心，PBS 洗三次。
3. 封閉
這一過程是為了減少抗體與其他非特異性蛋白質(zhì)之間的非特異性結(jié)合。常用10%正常山羊血清作為阻斷液(品種必須與二抗一致)。
4. 抗體孵育
(1) 根據(jù)推薦的稀釋比例制備一抗溶液。
(2) 一抗4℃孵育過夜。當(dāng)用到正常兔或小鼠 |gG 時(shí)，我們需要設(shè)置陰性對(duì)照。
(3) 用PBS 沖洗細(xì)胞三次。
(4) 在暗處按照推薦的稀釋比例配制二抗溶液。
(5) 二抗4℃孵育30min。
(6) 用PBS 沖洗細(xì)胞三次。
(7) 用500 μl PBS重懸檢測(cè)。
5. 檢測(cè)
將樣品置于黑暗中，盡快用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光信號(hào)。
常見問題
1. 怎么選擇合適的對(duì)照?
(1) 同型對(duì)照：使用同型抗體做平行實(shí)驗(yàn)，主要目的是消除抗體與樣本的非特異性結(jié)合。
(2) 陰性細(xì)胞對(duì)照：使用已知的不表達(dá)目標(biāo)抗原的細(xì)胞做平行實(shí)驗(yàn)，主要目的是消除抗體的非特異性結(jié)合。
(3) 二抗對(duì)照：第二抗體多為熒光標(biāo)記的多抗，非特異性結(jié)合一般較高，可能造成基礎(chǔ)熒光值偏高，設(shè)立二抗對(duì)照平行實(shí)驗(yàn)的主要目的是消除二抗的非特異性熒光著色。
(4) 陽性對(duì)照： 一般會(huì)使用已知的高表達(dá)目標(biāo)抗原的細(xì)胞做平行實(shí)驗(yàn)，主要目的是排除實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)方法、試劑、操作等實(shí)驗(yàn)的影響因素。
(5) 空白對(duì)照：不進(jìn)行任何標(biāo)記的細(xì)胞，主要目的是用于測(cè)定基礎(chǔ)熒光信號(hào) 表達(dá)值。
2. 收集的細(xì)胞通過流式儀檢測(cè)時(shí)， 一般多少的細(xì)胞量合適?
進(jìn)行流式檢測(cè)時(shí)，至少需要記錄5000個(gè)活細(xì)胞， 一般調(diào)整細(xì)胞密度至 1*10'/100ul 進(jìn)行流式檢測(cè)。
3. FCM 檢測(cè)過程中如何設(shè)門(gating)?
一般根據(jù)散射光進(jìn)行設(shè)門，即我們通常所說的前散(forward scatter, FSC) 和側(cè)散(side scatter, SSC)來設(shè)門。FSC 的大小與細(xì)胞的直徑成正相關(guān)，不 同的細(xì)胞，細(xì)胞越大，其FSC 越大；反之越小。SSC 的大小與細(xì)胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)的質(zhì)量成正相關(guān)，不同的細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，質(zhì)量越大，其SSC 越大；反之越小。
4. FCM 檢測(cè)過程中如何調(diào)節(jié)補(bǔ)償?
在FCM檢測(cè)過程中，如果存在多色，則必須進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)補(bǔ)償首先要知道雙陰性細(xì)胞的情況，其次，必須要用單陽和雙陰性細(xì)胞。只有在有陰性細(xì)胞作為參照的情況下，才能既不會(huì)過多又不會(huì)過少地調(diào)節(jié)補(bǔ)償。
5. FCM 檢測(cè)時(shí)，每次實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)一定要相同嗎?
FCM 檢測(cè)時(shí)，若不進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)而憑感覺隨意進(jìn)行實(shí)驗(yàn)會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié) 果。當(dāng)細(xì)胞量多而抗體量不變或細(xì)胞量不變而抗體量減少，那么熒光抗體平均分布到每個(gè)陽性細(xì)胞上的量就會(huì)相對(duì)減少。由此可見，不同的細(xì)胞量會(huì)影響最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，在準(zhǔn)備樣本時(shí)，必須進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使每個(gè)分組及每次實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)保持一致。
6. FCM 檢測(cè)時(shí)，如果存在多色分析，應(yīng)該如何進(jìn)行配色呢?
在FCM 檢測(cè)過程中，如果存在多色分析，雖然可以通過熒光補(bǔ)償來消除熒光光譜重疊的影響。但調(diào)節(jié)補(bǔ)償過大在一定程度上仍然會(huì)影響測(cè)值的準(zhǔn)確性，因此，我們一般建議盡量選擇熒光光譜重疊少的熒光抗體組合。
