組蛋白修飾檢測

1. 組蛋白修飾檢測方法

組蛋白修飾分析是一系列實(shí)驗(yàn)方法，用于分析和確定組蛋白的修飾狀態(tài)和位置，主要包括染色質(zhì)免疫沉淀（CHIP）和質(zhì)譜（MS）。這些方法利用特定的實(shí)驗(yàn)策略和工具，檢測帶有特定修飾的組蛋白分子，并定量確定它們的存在量和分布。

1.1 染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)（ChIP）

ChIP是一種常用的組蛋白修飾檢測技術(shù)，用于檢測修飾的存在及其與基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)。該技術(shù)使用特異性抗體結(jié)合修飾的組蛋白，將修飾的組蛋白從細(xì)胞或組織中富集出來。然后，可以通過PCR、測序或質(zhì)譜等方法對富集的修飾組蛋白進(jìn)行進(jìn)一步分析，確定修飾的存在和定位。

在檢測組蛋白修飾方面，有三種主要的基于ChIP的方法，包括ChIP-chip、ChIP-SAGE和ChIP-Seq。

在ChIP中，有兩種類型的ChIP：天然ChIP和交聯(lián)ChIP。天然ChIP使用通過核酸酶消化細(xì)胞核制備的天然染色質(zhì)。交聯(lián)ChIP使用甲醛固定的染色質(zhì)，并通過聲波破碎進(jìn)行斷裂。在表1中，我們對比了這兩種ChIP方法。

表1： 天然ChIP和交聯(lián)ChIP的比較

此外，您可以點(diǎn)擊以下鏈接查看ChIP操作具體流程：

天然染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)方案

交聯(lián)染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)方案

1.1.1 ChIP-chip

ChIP-chip（染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)合DNA微陣列雜交）是一種將染色質(zhì)免疫沉淀與DNA微陣列相結(jié)合的技術(shù)。與常規(guī)的ChIP一樣，ChIP-chip用于研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA的相互作用。實(shí)際上，ChIP-chip方法可用于研究許多表觀基因組現(xiàn)象。這里出現(xiàn)的示例展示了ChIP-chip在研究組蛋白修飾中的應(yīng)用。正如圖1所示：

首先，通過使用特定于特定組蛋白修飾的抗體免疫沉淀交聯(lián)染色質(zhì)來純化修飾的染色質(zhì)。然后，DNA被擴(kuò)增以獲得足夠的DNA（用一種顏色標(biāo)記）。用顏色標(biāo)記的ChIP DNA與從輸入染色質(zhì)中準(zhǔn)備的控制DNA混合，并用不同顏色標(biāo)記。隨后，微陣列探針可以映射到基因組上，得出基因組坐標(biāo)。然而，大多數(shù)ChIP-on-chip實(shí)驗(yàn)仍然使用多克隆抗體，這些抗體在批次之間的特異性不同。因此，生成和使用單克隆抗體進(jìn)行ChIP-on-chip實(shí)驗(yàn)是一個重要目標(biāo)。

1.1.2 ChIP-SAGE

ChIP-SAGE是指染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)合串聯(lián)分析基因表達(dá)。將ChIP實(shí)驗(yàn)與SAGE結(jié)合，可以在基因組范圍內(nèi)描述組蛋白修飾。ChIP-SAGE過程始于ChIP步驟，用于純化與特定組蛋白修飾相關(guān)的染色質(zhì)區(qū)域，然后按照以下步驟進(jìn)行。如圖2所示：

首先，交聯(lián)被逆轉(zhuǎn)，接著將生物素化的通用連接器（UL）連接到DNA末端，并將DNA結(jié)合到鏈霉親和素珠上。然后，使用識別CATG的Nla III酶消化DNA，將包含Mme I識別序列的連接器連接到切割的DNA末端。Mme I酶消化產(chǎn)生來自免疫沉淀片段的21-22 bp序列標(biāo)簽；這些序列標(biāo)簽被連接在一起，克隆到測序載體中，然后進(jìn)行測序。每個測序反應(yīng)中通常可以生成大約20到30個21 bp的短序列標(biāo)簽。然后，這些序列標(biāo)簽可以映射到基因組上，以識別修飾區(qū)域。

1.1.3 ChIP-Seq

ChIP-seq（染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)合高通量測序技術(shù)）是近年來在基因組尺度上研究表觀遺傳現(xiàn)象的最令人興奮的技術(shù)之一，它依賴于將ChIP實(shí)驗(yàn)與高通量測序技術(shù)相結(jié)合。ChIP-seq將ChIP與高通量DNA測序相結(jié)合，用于鑒定DNA相關(guān)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。如圖3所示：

這里概述的過程是針對使用Illumina Genome Analyzer和Solexa技術(shù)的。它可以分為兩個部分，ChIP和測序。第一步是使用特定于特定組蛋白修飾的抗體對修飾的染色質(zhì)進(jìn)行免疫沉淀。然后，修飾的ChIP DNA末端經(jīng)修復(fù)，并與一對適配器連接，隨后進(jìn)行有限的PCR擴(kuò)增。DNA分子結(jié)合到一個包含共價結(jié)合的寡核苷酸的流動細(xì)胞表面，這些核苷酸可以識別適配器序列。經(jīng)過尺寸選擇，所有產(chǎn)生的ChIP-DNA片段都可以使用基因組測序儀同時進(jìn)行測序。得到的序列讀數(shù)被映射到參考基因組上，以獲得與免疫沉淀片段對應(yīng)的基因組坐標(biāo)。

1.2 質(zhì)譜法（MS）

質(zhì)譜法近年來已成為鑒定和定量組蛋白修飾的首選方法。通過質(zhì)譜法鑒定和定位特定殘基的組蛋白修飾依賴于肽或蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)測量質(zhì)量和預(yù)期質(zhì)量之間的"質(zhì)量差"。理論上，這種方法使得在單次分析中可以對任何PTM或PTM組合進(jìn)行概要分析，而不受PTM類型或其特定位點(diǎn)的限制，并提供高度準(zhǔn)確的定量數(shù)據(jù)。

質(zhì)譜法已被證明是評估和比較不同樣本中特定修飾及其組合水平的有價值工具。

在生物樣本中，有三種基于質(zhì)譜法的方法可用于檢測組蛋白修飾，包括“自上而下”、“中間范圍”和“自下而上”的質(zhì)譜法 ^[5-8]。

1.2.1 “自上而下”方法

在“自上而下”方法中，完整的組蛋白被色譜分離，然后被離子化并進(jìn)行質(zhì)譜分析 ^[5,8]。由于完整組蛋白的高電荷狀態(tài)，可以從13+到25+不等，所以高分辨率的質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜對于這種技術(shù)至關(guān)重要。這個過程提供了在給定樣本中所有組蛋白同工型以及它們的總體化學(xué)計(jì)量學(xué)的詳細(xì)數(shù)據(jù)。

1.2.2 “中間范圍”方法

在“中間范圍”方法中，通過Glu-C或Asp-N的消化生成長的組蛋白肽，通常分子量超過5 kDa（>20個氨基酸）^[5,8]。通過這種方法，可以獲得完整的N-末端尾巴。例如，Asp-N產(chǎn)生H4 1–24肽，而Glu-C產(chǎn)生H3 1–50肽，其中包括了H4和H3中大多數(shù)著名PTM位點(diǎn)。盡管這兩種方法適合于檢測長程PTM關(guān)聯(lián)并估計(jì)其豐度，但是這兩種方法面臨的一個主要困難是區(qū)分異構(gòu)肽（具有相同修飾但位于不同位置的肽段），此外，這些方法通常面臨靈敏度降低和計(jì)算密集型數(shù)據(jù)分析的困擾。因此，“自上而下”和“中間范圍”質(zhì)譜法通常只在少數(shù)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，并且截至目前尚未有在臨床樣本中應(yīng)用的記錄。

1.2.3 “自下而上”方法

在“自下而上”質(zhì)譜法中，組蛋白在通過質(zhì)譜分析之前，經(jīng)過Arg‐C蛋白酶介導(dǎo)的酶促消化為相對較短的肽（長度為5-20個氨基酸）。由于核心組蛋白富含堿性氨基酸殘基，胰蛋白酶產(chǎn)生的肽太短，并且在修飾位點(diǎn)附近低效切割，導(dǎo)致長度不一致，不適合準(zhǔn)確定量。在胰蛋白酶切割之前，通過氘化乙酸酐或丙酸酐在N-末端和賴氨酸上的游離胺衍生通常用于模擬Arg-C消化，同時使用強(qiáng)大的胰蛋白酶 ^{[9-12]。這種策略也有助于區(qū)分等壓肽 [10]。}

雖然“自下而上”提供有限的同時發(fā)生的PTM數(shù)據(jù)（最多四個），特別是對于遠(yuǎn)處的標(biāo)記，但它提供了靈活性，并在分析患者來源的樣本中具有應(yīng)用。

2. 組蛋白修飾檢測的應(yīng)用

組蛋白修飾檢測在表觀遺傳學(xué)研究和個體化醫(yī)學(xué)中至關(guān)重要。它有助于理解基因調(diào)控機(jī)制，探索細(xì)胞分化和組織發(fā)育過程，識別疾病生物標(biāo)志物，并開發(fā)靶向治療方法。

2.1 揭示基因調(diào)控機(jī)制

組蛋白修飾檢測可以幫助我們揭示基因調(diào)控機(jī)制。通過分析基因啟動子和增強(qiáng)子中不同修飾的分布，我們可以了解組蛋白修飾在基因表達(dá)中的調(diào)節(jié)作用，并進(jìn)一步了解基因調(diào)控的詳細(xì)機(jī)制。

2.2 研究發(fā)育和細(xì)胞命運(yùn)決定

組蛋白修飾檢測在發(fā)育過程和細(xì)胞命運(yùn)決定中發(fā)揮重要作用。通過分析修飾的動態(tài)變化，我們可以研究細(xì)胞分化和組織發(fā)育的分子機(jī)制，以及干細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)控。

2.3 探索疾病發(fā)病機(jī)制

組蛋白修飾的檢測幫助我們了解疾病的機(jī)制。不同疾病中異常的組蛋白修飾模式可以為疾病的發(fā)生和發(fā)展提供重要線索，從而為疾病的診斷和治療提供新的靶標(biāo)和策略。

參考文獻(xiàn)：

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