淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志物

1. 為什么要鑒定不同的淋巴細(xì)胞亞群？

淋巴細(xì)胞亞群的平衡維持著機(jī)體正常的免疫功能。淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量和功能的異常變化會導(dǎo)致一系列病理變化和免疫功能紊亂，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。研究表明，淋巴細(xì)胞亞群在腫瘤形成 ^{[1] [2]}、傳染病 ^{[3] [4]}、器官移植 ^{[5] [6]}、自身免疫性疾病、糖尿病等過程中起著重要作用。因此，臨床上淋巴細(xì)胞亞群的鑒定和監(jiān)測具有重要意義。

2. 如何鑒定不同的淋巴細(xì)胞亞群？

三種類型的淋巴細(xì)胞在形態(tài)上基本相似，需要通過表面標(biāo)志物檢測來區(qū)分不同的亞群。淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志物根據(jù)淋巴細(xì)胞類型和分化階段而異。

3. 什么是細(xì)胞表面標(biāo)志物？

細(xì)胞表面標(biāo)志物是嵌入在細(xì)胞膜脂雙層結(jié)構(gòu)中的膜蛋白，通常包括膜抗原、膜受體和其他分子。淋巴細(xì)胞與周圍環(huán)境中的其他細(xì)胞和分子之間的相互作用，以及在抗原中淋巴細(xì)胞的生物效應(yīng)，包括識別、激活、輔助、抑制和殺傷，都與它們的表面標(biāo)志物有關(guān)。利用細(xì)胞表面標(biāo)志物來區(qū)分T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞極大地推動了免疫現(xiàn)象的細(xì)胞基礎(chǔ)分析 ^[7]。

淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志物的檢測在基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)研究以及患者免疫功能測定中得到廣泛應(yīng)用。淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志物通常分為三大類：表面免疫球蛋白（SIg）、分化抗原（或特異性抗原）和膜受體。CD（分化簇）分子是最常用的細(xì)胞表面標(biāo)志物之一。

4. T淋巴細(xì)胞及其細(xì)胞表面標(biāo)志物

4.1 T淋巴細(xì)胞

T細(xì)胞是特異性抗原的淋巴細(xì)胞，源自造血組織并在胸腺中成熟。它們得名于此——胸腺依賴性淋巴細(xì)胞。T細(xì)胞可以分為輔助T細(xì)胞（Th）、細(xì)胞毒性T細(xì)胞（Tc）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）。Th/Tc比例的改變會改變機(jī)體的免疫功能 ^[8]。當(dāng)受到抗原刺激時，T淋巴細(xì)胞會轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，然后分化為致敏的T淋巴細(xì)胞，參與細(xì)胞免疫。它主要抵御細(xì)胞內(nèi)感染、腫瘤細(xì)胞和同種異體細(xì)胞。

NKT淋巴細(xì)胞是具有NK細(xì)胞特性的T淋巴細(xì)胞亞群 ^[9]，它們既具有T淋巴細(xì)胞的抗腫瘤免疫活性，又具有NK細(xì)胞的非MHC限制性抗腫瘤特性 ^[10]。它們在抗感染、抗腫瘤、自身免疫平衡調(diào)節(jié)等方面起著重要作用^[11]。

4.2 T淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)志物

在T淋巴細(xì)胞中，輔助T細(xì)胞可以進(jìn)一步分為Th0、Th1、Th2、Th3（TGF-β）、Th17（IL17）等。

通過相對特異的CD抗原標(biāo)記可以區(qū)分Th1和Th2：

Th1---CD3 +CD4+CD30-

Th2---CD3+CD4+CD30+

研究表明，Th1具有明顯的細(xì)胞毒性效應(yīng)，主要分泌細(xì)胞因子如IL2、IFN-γ或TNF-β，以協(xié)助細(xì)胞免疫或參與遲發(fā)型超敏反應(yīng)。Th1細(xì)胞表面標(biāo)志物還包括IL-12β2R ^[12] 和IL-18R ^[13]。Th2沒有細(xì)胞毒性效應(yīng)，主要分泌細(xì)胞因子如IL4、IL5、IL6或IL10，以協(xié)助體液免疫，并參與快速型超敏反應(yīng)。

研究發(fā)現(xiàn) ^[14]，Th1/Th2不平衡紊亂與多種疾病過程有關(guān)，如腫瘤免疫、移植免疫和過敏。

在T淋巴細(xì)胞中，細(xì)胞毒性T細(xì)胞（Tc）還可以進(jìn)一步分為：

Tc1（IFN-γ）和Tc2（IL-4、IL5、IL-10）。

區(qū)分Tc1和Tc2的相對特異的CD抗原標(biāo)記：

Tc1---CD3+CD8+CD30-

Tc2---CD3+CD8+CD30+

以下表格是T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物。

表1. 主要CD抗原及其在T細(xì)胞表面的分布

4.2.1 CD2

CD2，又稱為LFA2，是一種黏附分子，能與綿羊紅細(xì)胞（SRBC）結(jié)合，也被稱為綿羊紅細(xì)胞受體（E受體）。它的配體是LAF3。它增強(qiáng)了T細(xì)胞與APCs或靶細(xì)胞之間的黏附，并促進(jìn)T細(xì)胞對抗原的識別。其細(xì)胞質(zhì)域可以與多種酪氨酸激酶結(jié)合，介導(dǎo)信號傳導(dǎo)。

4.2.2 CD3

CD3與TCR跨膜區(qū)結(jié)合形成穩(wěn)定的TCR-CD3復(fù)合物。在這個復(fù)合物中，TCR負(fù)責(zé)識別抗原肽-MHC分子復(fù)合物，而CD3分子負(fù)責(zé)將激活信號傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)。

CD3分子的細(xì)胞質(zhì)域含有與免疫細(xì)胞激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM），表明它參與免疫細(xì)胞的激活。

4.2.3 CD4

CD4是T輔助細(xì)胞的標(biāo)記，是一種單鏈跨膜蛋白。其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)屬于IgSF，有四個IgSF結(jié)構(gòu)域。第一和第二結(jié)構(gòu)域可以與MHCII類分子結(jié)合。CD4作為TCR-CD3復(fù)合物識別抗原的輔助受體，通過與MHCII分子、p56lek激酶結(jié)合，參與信號傳導(dǎo)。

4.2.4 CD8

CD8是細(xì)胞毒性T細(xì)胞的標(biāo)記，是由α鏈和β鏈通過二硫鍵連接形成的異二聚體，其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)是IgSF成員。CD8分子的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域可以與p56lek激酶結(jié)合，參與信號傳導(dǎo)。CD8+T淋巴細(xì)胞能夠特異性地殺傷靶細(xì)胞，具有抗腫瘤、抗病毒和重要的免疫調(diào)節(jié)作用，其主要功能是抑制免疫應(yīng)答 ^[15]。

CD4和CD8分子將T細(xì)胞分為兩個明顯的亞群。CD4和CD8分別是MHCII類或MHCI類分子的受體，CD4+和CD8+細(xì)胞數(shù)量和比例的變化反映了機(jī)體的免疫功能狀態(tài)。

4.2.5 CD28 和 CTLA-4（CD152）

它們是經(jīng)典的共刺激分子。在結(jié)構(gòu)上，兩者高度同源，由兩個多肽鏈連接形成同源二聚體。

CD28：在幾乎所有CD4+ T細(xì)胞中表達(dá)，50%的CD8+ T細(xì)胞中表達(dá)。漿細(xì)胞和部分活化的B細(xì)胞也表達(dá)CD28。

CTLA-4：僅在活化的T細(xì)胞上表達(dá)。

CD28和CTLA-4的天然配體是B7（CD80/CD86）。

CD28-B7（CD80/CD86）提供了T細(xì)胞激活的第二信號（共刺激信號）。

CTLA-4-B7（CD80/CD86）提供了激活的T細(xì)胞抑制信號。

4.2.6 CD40L（CD154）

它屬于Ⅱ型跨膜蛋白，主要在CD4+ T細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞表面的激活中表達(dá)。CD40L與B細(xì)胞表面的CD40相互作用，提供協(xié)同刺激信號，促進(jìn)B細(xì)胞增殖、分化、抗體合成和依賴于胸腺抗原（TD-Ag）的免疫應(yīng)答。

4.2.7 病毒受體

通過這些受體，病毒可以選擇性地感染T細(xì)胞的一個子群。例如，HIV可以通過感染輔助T細(xì)胞（CD4+細(xì)胞）來引發(fā)艾滋病。

4.2.8 其他表面標(biāo)志物

包括白細(xì)胞介素受體、整合素受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體等。

5. B淋巴細(xì)胞及其細(xì)胞表面標(biāo)志物

5.1 B淋巴細(xì)胞

B細(xì)胞是來源于造血組織的特異性抗原淋巴細(xì)胞。與T細(xì)胞不同，B細(xì)胞在骨髓中分化和成熟。受抗原刺激后，B淋巴細(xì)胞首先轉(zhuǎn)化為漿母細(xì)胞，然后分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生和分泌免疫球蛋白（抗體），參與體液免疫。其功能包括產(chǎn)生抗體、呈遞抗原，以及分泌參與免疫調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子 ^[16]。B細(xì)胞及其亞群的檢測是研究自身免疫疾病和疾病中的免疫調(diào)節(jié)紊亂的重要指標(biāo)。

5.2 B細(xì)胞表面標(biāo)志物

5.2.1 B細(xì)胞抗原受體，BCR / 表面膜免疫球蛋白，SmIg

它是嵌入在細(xì)胞膜脂質(zhì)分子中的免疫球蛋白，在成熟的B細(xì)胞和大多數(shù)B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。成熟的B細(xì)胞主要表達(dá)mIgM和mIgD，其含量也反映了細(xì)胞成熟的程度：IgM > IgD較為不成熟，IgD > IgM較為成熟。

BCR是B細(xì)胞最具特征性的表面標(biāo)志物。它可以特異性地結(jié)合相應(yīng)的抗原，也可以特異性地結(jié)合抗免疫球蛋白抗體。

5.2.2 補(bǔ)體受體（CR）

成熟的B細(xì)胞表面表達(dá)補(bǔ)體受體，主要是C3受體。

補(bǔ)體受體1（CR1），也稱為C3b受體或C3b / C4b受體，與C3b和C4b結(jié)合，促進(jìn)B細(xì)胞激活。

補(bǔ)體受體2（CD21），B細(xì)胞的一個重要標(biāo)記，也稱為C3d受體，同時也是Epstein-Barr病毒的受體。

5.2.3 分化抗原

CD19，CD20，CD21和CD40通常用于B細(xì)胞功能分析。

此外，還包括有絲分裂原受體、Fc受體、MHC抗原等表面標(biāo)志物。

6. 自然殺傷細(xì)胞及其細(xì)胞表面標(biāo)志物

6.1 自然殺傷細(xì)胞

自然殺傷細(xì)胞是胞漿中含有大顆粒的細(xì)胞。NK細(xì)胞的確切來源尚不明確，一般認(rèn)為直接來源于骨髓。激活的NK細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性 ^[19]發(fā)揮抗病毒 ^[17]、抗腫瘤 ^[18]和免疫調(diào)節(jié)作用。

6.2 NK細(xì)胞表面標(biāo)志物

目前，CD3-CD16+CD56+通常被用作其典型標(biāo)志。

CD16（FcγRIII），CD56（NCAM-1），CD94，CD158（KIR）和CD161（NKR-P1A）通常用于NK細(xì)胞功能分析。

綜上所述，淋巴細(xì)胞亞群可以通過細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行區(qū)分，見表2。

表2. T、B、NK細(xì)胞表面標(biāo)志物物比較

7. 淋巴細(xì)胞的檢測

7.1 免疫熒光法

免疫熒光法包括間接免疫熒光法和直接免疫熒光法。

間接免疫熒光法的過程：首先，待檢測的細(xì)胞經(jīng)過無標(biāo)記抗體處理，與特定抗原形成復(fù)合物，然后使用熒光標(biāo)記的抗抗體來檢測細(xì)胞中特定抗原的存在，從而產(chǎn)生熒光增強(qiáng)效應(yīng)。

B細(xì)胞表面標(biāo)志物-SmIg可以通過間接免疫熒光法進(jìn)行檢測。

這種方法的特點(diǎn)具有很強(qiáng)的特異性，可以通過顯微鏡觀察準(zhǔn)確地確定組織或細(xì)胞中熒光的分布情況。

7.2 免疫細(xì)胞化學(xué)

該方法通常采用酶聯(lián)免疫測定，如生物素-鏈霉素系統(tǒng)。通過顯微鏡，表現(xiàn)為棕黃色的細(xì)胞被判定為CD抗原陽性細(xì)胞。

7.3 紅細(xì)胞花環(huán)試驗(yàn)

將用相應(yīng)抗體標(biāo)記的紅細(xì)胞作為指示物，與待檢測的細(xì)胞混合。

羊紅細(xì)胞（SRBC）與人類淋巴細(xì)胞（E花環(huán)）自發(fā)形成花環(huán) ^{[20] [21]}。因此，可以用于檢測T細(xì)胞上的SRBC受體。這種方法的原理是利用T細(xì)胞表面的SRBC受體與SRBC形成花環(huán)。

該方法簡單，試劑相對便宜。這是一種經(jīng)典的T淋巴細(xì)胞檢測方法。但其缺點(diǎn)是結(jié)果不太穩(wěn)定，受個人主觀影響。

8. 淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志物的應(yīng)用

淋巴細(xì)胞亞群的分析可以揭示患者免疫功能的平衡情況。

8.1 在腫瘤疾病中的應(yīng)用

機(jī)體的免疫功能與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

腫瘤患者外周血的T淋巴細(xì)胞亞群異常?；颊叩腃D3+細(xì)胞和CD4+細(xì)胞顯著減少，而CD8+細(xì)胞顯著增加。這種免疫抑制狀態(tài)降低了患者識別和殺傷突變細(xì)胞的能力。

8.2 在自身免疫性疾病中的應(yīng)用

自身免疫性疾病患者的淋巴細(xì)胞亞群通常受到干擾。淋巴細(xì)胞比例的變化與自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān) ^[22]。

CD4+/CD8+比率的增加會導(dǎo)致自身免疫疾病 ^[23]。

淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志物還可以用于研究淋巴細(xì)胞分化的過程和功能。不同淋巴細(xì)胞群體的數(shù)量和功能的變化也可能與各種疾病的發(fā)生有關(guān)。例如，艾滋病患者的CD4+T細(xì)胞顯著減少甚至缺失。

因此，檢測淋巴細(xì)胞亞群在控制某些疾病的發(fā)生和發(fā)展、了解發(fā)病機(jī)制以及指導(dǎo)臨床治療方面具有重要意義。