NKG2D，一個極具潛力的CAR-T和CAR-NK靶點
日期：2021-08-17 15:33:50
NKG2D，是一種在人類天然殺傷細胞，CD56+和CD8+T細胞表面表達的激活性受體，在天然免疫中發(fā)揮著重要的作用，參與病毒感染細胞的識別及 NK 對腫瘤細胞的殺傷。2020年11月，臨床階段生物制藥公司 Nkarta Therapeutics宣布在 NKX101 的 I 期臨床試驗中已完成首位患者給藥。NKX101是Nkarta所研發(fā)的第一個靶向 NKG2D 的 “通用型” CAR-NK 細胞療法。用于治療復發(fā) / 難治性急性髓細胞白血?。ˋML）或高危骨髓增生異常綜合征（MDS）。但這并不是NKG2D第一次出現(xiàn)在細胞療法中，早在2018年，Celyad研發(fā)的CYAD-01（又名CAR-T NKG2D，是一種CAR-T細胞療法）在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌治療評估中取得重要里程碑，而且接受NKG2D-CAR-T治療的r/r AML患者獲得完全緩解。那么NKG2D究竟是什么？它的生物學作用又是什么？
1、NKG2D的結(jié)構(gòu)和功能
NKG2D基因位于NK基因復合體（NKC）中，是1991年在篩選人類NK細胞的優(yōu)勢表達基因時發(fā)現(xiàn)的，同時篩選出的還有相鄰的NKG2A、NKG2C和NKG2E。NKG2基因編碼的分子全部表達在細胞膜上，屬II型跨膜受體，序列與C型凝集素相似。NKG2D基因位于人染色體12p12-12p13或小鼠4號染色體NK復合體中（圖一）[1]。
Figure 1. Chromosome localization of NKG2D
*This diagram is derived from reference 1.
NKG2D蛋白是由KLRK1基因編碼的42 KDa蛋白，具有功能性單核苷酸多態(tài)性（SNPs）[2]。KLRK1基因長度為37793個堿基，位于12號染色體負鏈的10416219-10454012 bp處。ENTREZ數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)顯示，它包含12個外顯子。在人KLRK1的三個等位基因中發(fā)現(xiàn)了兩個核苷酸位點的同義和非同義替換，這可能是有限多態(tài)性。同源基因KLRK1的有限多態(tài)性在小鼠中也已被證實。KLRK1的同源基因存在于哺乳動物和有袋動物的所有基因組中，在進化過程中高度保守（圖2）。作為一種活性受體，NKG2D可以在人類和小鼠的NK細胞、CD8+T細胞和其他免疫活性細胞中表達，但在CD4+T細胞中通常不表達[3]。
Figure 2. The gene structure of human NKG2D
*This diagram is derived from reference 1.
2、NKG2D的配體
與其他NKG2受體不同，NKG2D擁有多種配體，包括人類MHC-I類鏈相關(guān)分子（MICA和MICB）和人類UL16結(jié)合蛋白（ULBPs，也稱為人類RAET1）。NKG2D配體大都為多片段組成的跨膜蛋白，但也有部分RAET1蛋白缺乏跨膜結(jié)構(gòu)，他們通過糖基磷脂酰肌醇錨固在細胞膜上。
2.1人類MHC-I類鏈相關(guān)分子
人類MHC-I類鏈相關(guān)分子（MIC）位于人類6號染色體短臂上MHC I類基因區(qū)，目前認為在MIC基因7個成員（MICA-MICG）中MICA和MICB能夠被轉(zhuǎn)錄，而MICC、MICD、MICE和MICG 4個基因均為假基因。MICA和MICB編碼區(qū)有90%以上的同源序列。MIC分子有a1、a2和a3三個胞外結(jié)構(gòu)域，一個跨膜區(qū)和一個羧基胞質(zhì)區(qū)。與經(jīng)典MHCI類分子明顯不同的是，MIC分子不與β2微球蛋白結(jié)合。在正常人體內(nèi)MIC分布僅局限于胃腸道上皮、內(nèi)皮細胞以及成纖維細胞。在感染、腫瘤以及器官移植受體組織細胞中都有MIC的表達。已有研究證實許多上皮來源的腫瘤，比如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤以及黑色素瘤中都有MIC的產(chǎn)生，MIC被認為是一種腫瘤相關(guān)性抗原 [4] [5]。
2.2 人類UL16結(jié)合蛋白
UL16蛋白是人巨細胞病毒感染細胞表達的一種跨膜糖蛋白，Cosman等利用UL16-Fc融合蛋白發(fā)現(xiàn)了兩種結(jié)合UL16蛋白，命名為ULBP1和ULBP2 [6]。ULBP是一類人類細胞表面分子，目前已發(fā)現(xiàn)四個ULBP，不同ULBP分子有50% ~ 60%的相同氨基酸序列，與MIC和MHC-I類分子之間有大約25%的序列同源。ULBP結(jié)構(gòu)均帶有MHC I類分子樣a1、a2結(jié)構(gòu)域，但缺乏免疫球蛋白樣a3結(jié)構(gòu)域，同樣也不與β2微球蛋白結(jié)合。ULBP1、ULBP2和ULBP3是GPI連接蛋白，而ULBP4則是跨膜蛋白 [7] [8] [9]。與MIC相比，ULBP表達更為廣泛，在多種正常組織及腫瘤均有表達。ULBP在病毒感染及人類巨細胞病毒逃脫免疫監(jiān)視過程中起重要作用 [10].
3、NKG2D信號傳導
NKG2D不是典型的NKC2家族成員，與其他成員（NKG2A、NKG2C和NKG2E）只有21%的同源性，結(jié)構(gòu)和功能都存在明顯差異。NKG2A、NKG2C以及NKG2E分子的蛋白序列極為相似，它們在細胞表面與CD94分子形成異二聚體，通過識別 “缺失性自我”(missing self)，即對自身主要組織相容性復合體MHC-I類分子的“識別”，介導NK細胞的殺傷活性。NKG2D不與CD94結(jié)合，而是自身形成同源二聚體表達于細胞表面。另外，NKG2D信號傳導方式也有差異，其胞漿區(qū)不具信號轉(zhuǎn)導功能，跨膜區(qū)與轉(zhuǎn)接蛋白DAP10同源二聚體結(jié)合。NKG2D作為一種重要的激活受體，可以通過誘導契合理論特異性結(jié)合DAP10，進而誘導磷酸化[11]。DAP10不含免疫受體酪氨酸活化基序ITAM，而是含有-YxxM基序。NKG2D與配體結(jié)合后，NKG2D同源二聚體跨膜區(qū)域的帶電氨基酸殘基通過兩個鹽橋連接到DAP10的TM殘基上，形成六聚體結(jié)構(gòu)（圖3），繼而誘導細胞質(zhì)中YxxM 基序的磷酸化，然后激活下游磷酸肌醇3激酶(PI3K)信號通路，傳遞活化信號。NKG2D產(chǎn)生的信號可直接激活NK細胞發(fā)揮殺傷效應，并作為協(xié)同刺激信號促進αβT細胞和γδT細胞的活化并增強其殺傷效應。
Figure 3. The interaction between NKG2D and its ligands
*This diagram is derived from reference 1.
自1997年全球首款抗CD20單抗——羅氏的利妥昔單抗獲批以來，全球已經(jīng)批準多款抗CD20單抗。根據(jù)人源化程度以及Fc片段修飾，抗CD20單抗可分為三代，其中第一代是以利妥昔單抗為代表的嵌合或者鼠源單抗，第二代是以奧法木單抗為代表的人源化單抗，第三代的抗CD20單抗以奧妥珠單抗為代表，其抗體的Fc片段經(jīng)過了糖基化修飾。
4、NKG2D/ NKG2DL與腫瘤免疫
從第三部分NKG2D傳導可以發(fā)現(xiàn)，NKG2D的生物學功能與其配體息息相關(guān)。在這部分中，我們重點闡明了NKG2D及其配體在腫瘤免疫中的作用。
- NKG2D/ NKG2DL可以介導免疫細胞的腫瘤殺傷作用。這種殺傷作用是由多種免疫細胞及免疫因子共同參與實現(xiàn)的。NK細胞具有搜尋“缺乏自我”細胞的功能，是機體免疫系統(tǒng)免疫監(jiān)視及抑制腫瘤生長第一道防線，無需抗原刺激即可殺傷腫瘤細胞 [12]。腫瘤細胞的表面MHCI類分子產(chǎn)生減少，因此其不能被抑制性受體識別，無法傳導負調(diào)節(jié)信號，致使NK細胞處于激活狀態(tài)而殺傷上述靶細胞。然而部分腫瘤細胞即使表達MHCI類分子，仍可被NK細胞識別，這是因為其同時表達NKG2D配體，激活NK細胞“識別異我”功能，防止腫瘤細胞免疫逃逸。除了NK細胞外，NKG2D受體也可表達于多種T細胞表面，根據(jù)TCR的不同，T細胞可分為αβT細胞和γδT細胞。以肺癌為例，肺組織中主要分布的為γδT細胞，NKG2D幾乎可表達于全部的γδT細胞的細胞膜表面。而γδT細胞可直接識別肺癌細胞表面的MICA、MICB等NKG2DL，并與之結(jié)合，進而誘導強烈的細胞毒性作用殺傷表達NKG2DL的肺癌細胞。
- NKG2D配體在腫瘤細胞中的免疫監(jiān)督作用。早期Bauer等報道腫瘤細胞在表達NKC2D配體MIC-A后，通過NKC2D能夠有效地被清除。小鼠NK細胞也能有效的清除被轉(zhuǎn)染H60或者RAE-1的RMA細胞。還有報道骨髓瘤細胞系在表達NKC2D配體后，NK細胞通過NKC2D能夠識別這些配體并排斥骨髓瘤細胞。眾所周知，DNA損傷在許多腫瘤中被激活。DNA損傷的激活可以認為是腫瘤細胞和免疫細胞之間的傳感器。DNA損傷能夠誘導腫瘤細胞在細胞表面表達NKC2D配體。這些腫瘤細胞能夠被具有NKC2D的免疫細胞標記為可殺傷細胞。在傳統(tǒng)的化療和放療過程中DNA的損傷常常誘導NKC2D配體的產(chǎn)生從而激發(fā)免疫細胞識別腫瘤細胞引起免疫應答。有人報道使腫瘤相關(guān)抗原特異性抗體的Fab片段與重組的MIC-A相結(jié)合,在抗體識別腫瘤相關(guān)抗原后，可使MIC-A包被整個腫瘤細胞。MIC-A包被的腫瘤細胞易于被NK細胞識別并裂解[13]。2008年，SongH等發(fā)現(xiàn)IL-18可以在mRNA和蛋白質(zhì)水平提高白血病細胞ULBP2的表達，通過磷酸化ERKY2和JNKMAPK信號通路來增強NK細胞對腫瘤細胞的殺傷作用 [14]。
5、NKG2D臨床研究
目前以NKG2D為靶點的在研藥物/療法主要集中在臨床早期，作用機制以CAR-T/CAR-NK為主，適應癥以血液瘤為主。從目前臨床研究成果來看，CAR-T療法比較多，截至目前，全球有11種針對NKG2D的在研藥物，其中以CAR-T細胞療法為作用機制的就有10種。而CAR-NK療法因為沒有發(fā)現(xiàn)細胞因子釋放綜合癥及神經(jīng)毒性等副作用，因而比CAR-T療法具有優(yōu)勢，這可能是由于NK細胞本身不容易導致過高的細胞因子分泌。除此之外CAR-NK療法不需要以患者的自體免疫細胞作為來源、治療成本更低等優(yōu)勢可能使它成為CAR-T療法的一大競爭對手。除抗腫瘤藥物外，強生旗下的楊森公司針對該靶點在自身免疫疾病方面的作用開發(fā)了一款單抗類藥物，通過抑制該靶點活性來降低克羅恩病患者的炎癥反應。
| 藥物名稱 | 研發(fā)狀態(tài) | 研發(fā)機構(gòu) | 適應癥 | 藥物類型 |
|---|---|---|---|---|
| CYAD 01 (Dartmouth College) | 臨床二期 | Celyad；達特茅斯學院；小野制藥 | 骨髓增生異常綜合征；骨髓增生性疾?。欢喟l(fā)性骨髓瘤；急性髓細胞樣白血病 | 嵌合抗原受體T細胞療法（CAR-T） |
| NKG2D-ACE2 CAR-NK cell therapy | 臨床二期 | 重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療中心；斯德姆生物 | 新型冠狀病毒肺炎 | 生物藥 |
| Tesnatilimab | 臨床二期 | Janssen Research & Development Llc | 克羅恩病 | 人源化單克隆抗體 |
| NKG2D CAR-T Cell therapy | 臨床一期 | 浙江大學；Yake Biotechnology | 急性髓細胞樣白血病 | 嵌合抗原受體T細胞療法（CAR-T） |
| Anti-NKG2D-ligand NK-cell therapy | 臨床一期 | 廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院 | 腫瘤 | 生物藥 |
| CAR-grafted gamma delta T cell therapy (CytoMed) | 臨床一期 | Cytomed Therapeutics | 鼻咽腫瘤；鼻咽癌；結(jié)直腸癌；前列腺癌；肉瘤；三陰性乳腺腫瘤；胃癌 | 嵌合抗原受體T細胞療法（CAR-T） |
| KD-025 | 臨床一期 | 南京凱地生物科技有限公司 | 肝細胞癌；膠質(zhì)母細胞瘤；結(jié)腸癌；髓母細胞瘤 | 嵌合抗原受體T細胞療法（CAR-T） |
| NKG2D CAR-T cell therapy (Uwell Biopharma) | 臨床階段不明 | Uwell Biopharma | 腫瘤 | 嵌合抗原受體T細胞療法（CAR-T） |
| NKX101 | 臨床一期 | Nkarta | 骨髓增生異常綜合征，急性髓系白血病 | 細胞療法（CAR-NK） |
| CYAD-101 | 臨床一期 | Celyad | 結(jié)直腸癌 | 嵌合抗原受體T細胞療法（CAR-T） |
| CYAD-02 | 臨床一期 | Celyad | 骨髓增生異常綜合征，急性髓系白血病 | 嵌合抗原受體T細胞療法（CAR-T） |
參考文獻：
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