重組蛋白的生產(chǎn)工藝流程
日期：2024-01-26 10:17:03
蛋白質(zhì)具有重要的功能，因此被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、營養(yǎng)和醫(yī)療領(lǐng)域。DNA 重組技術(shù)是生產(chǎn)大量特定蛋白質(zhì)的一種重要方法，該技術(shù)通過基因重組將多種來源的遺傳物質(zhì)結(jié)合在一起，創(chuàng)造出基因組中天然不存在的 DNA 序列。利用 DNA 重組技術(shù)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)就是所謂的重組蛋白。
為了幫助你更好地了解重組蛋白是如何產(chǎn)生的，本文將介紹這些內(nèi)容：
什么是重組 DNA？
如何制造重組 DNA？
什么是重組蛋白？
如何生產(chǎn)重組蛋白？
1. 什么是重組 DNA？
要弄清什么是重組 DNA 以及如何利用重組 DNA 技術(shù)生產(chǎn)特定蛋白質(zhì)，首先應(yīng)該了解生物體內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)的相關(guān)知識。
對于任何生物體來說，蛋白質(zhì)都是構(gòu)成機(jī)體并發(fā)揮重要功能的最重要物質(zhì)之一。例如，人之所以能夠消化食物，是因為消化道分泌消化酶，將食物中的大分子分解成可以被人體吸收的小分子。所有這些酶都是蛋白質(zhì)。
自從 DNA 螺旋結(jié)構(gòu)于 1953 年被發(fā)現(xiàn)以來，人們對遺傳原理進(jìn)行了廣泛的研究?，F(xiàn)在，人們已經(jīng)清楚地認(rèn)識到，蛋白質(zhì)是由 DNA 通過兩個步驟制造出來的。第一步稱為轉(zhuǎn)錄，即從 DNA 生成 mRNA。下一步是翻譯，由 mRNA 生成蛋白質(zhì)。換句話說，DNA 序列提供了制造特定蛋白質(zhì)的指令。因此，基因表達(dá)實際上與蛋白質(zhì)表達(dá)具有相同的含義。
圖 1 基因表達(dá)
重組 DNA（rDNA）是由兩個或多個 DNA 序列組合而成的 DNA 鏈?；蛑亟M是一個自然發(fā)生的過程。這一過程也可以為各種目的進(jìn)行人工操作，這就是所謂的 DNA 重組技術(shù)。利用 DNA 重組技術(shù)，科學(xué)家能夠創(chuàng)造出在正常情況和環(huán)境條件下不會自然存在的新 DNA 序列。由此產(chǎn)生的重組 DNA 被放入宿主細(xì)胞，在那里表達(dá)成一種新的蛋白質(zhì)，這就是所謂的重組蛋白。DNA 重組技術(shù)在生產(chǎn)用于制藥、醫(yī)療、農(nóng)業(yè)和其他用途的重組蛋白方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。
2. 如何制造重組 DNA？
DNA 重組技術(shù)還有其他名稱，包括 DNA 克隆、分子克隆和基因克隆。它們都是指將外來 DNA 轉(zhuǎn)移到生物體內(nèi)可自我復(fù)制的遺傳元件中，最終導(dǎo)致外來 DNA 的擴(kuò)增。目前，制造重組 DNA 的方法主要有以下三種：
① 轉(zhuǎn)化
將外來 DNA 片段切割并插入載體，通常是質(zhì)粒。然后，將產(chǎn)生的載體放入宿主細(xì)胞，如大腸桿菌，在其中表達(dá)外來 DNA 片段。細(xì)菌細(xì)胞吸收外來 DNA 的過程稱為轉(zhuǎn)化。
② 非細(xì)菌轉(zhuǎn)化
非細(xì)菌轉(zhuǎn)化不使用細(xì)菌作為宿主細(xì)胞。其中一個例子是 DNA 微注射，即把外來 DNA 直接注射到受體細(xì)胞的細(xì)胞核中。生物彈射法是一種利用高速微彈丸將外來 DNA 射入受體細(xì)胞的方法。
③ 噬菌體導(dǎo)入
噬菌體導(dǎo)入法是利用噬菌體將外來 DNA 轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，最終將含有外來 DNA 的噬菌體 DNA 植入宿主細(xì)胞的基因組。
3. 什么是重組蛋白？
重組蛋白是通過 DNA 重組技術(shù)人工制造的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)可用于許多領(lǐng)域，如診斷工具、疫苗、治療劑、洗滌劑、化妝品、食品生產(chǎn)和飼料添加劑等。僅僅從天然來源中分離蛋白質(zhì)無法滿足日益增長的蛋白質(zhì)需求。DNA 重組技術(shù)為獲取大量蛋白質(zhì)提供了一種更有效的方法。
這種方法有利有弊。例如，胰島素是一種對血糖起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的激素，糖尿病患者的胰島素會減少，而 DNA 重組技術(shù)已經(jīng)生產(chǎn)出了胰島素，挽救了許多人的生命。此外，DNA 重組技術(shù)還可以操縱相關(guān)蛋白質(zhì)的特性。從這些方面來看，DNA 重組技術(shù)和重組蛋白都是有益的。然而，人們對使用重組 DNA 技術(shù)的安全性和倫理道德仍有擔(dān)憂。
4. 如何生產(chǎn)重組蛋白？
重組蛋白的生產(chǎn)曾經(jīng)是專家的領(lǐng)域。現(xiàn)在，由于簡單的商業(yè)化系統(tǒng)的發(fā)展，重組蛋白的生產(chǎn)已經(jīng)成為一項非常成熟和廣泛的技術(shù)。在重組蛋白的生產(chǎn)過程中，仍然存在的一個挑戰(zhàn)是，你將面臨一系列令人困惑的選擇。
應(yīng)該使用哪種系統(tǒng)來表達(dá)蛋白質(zhì)？
使用哪種表達(dá)載體？
蛋白質(zhì)應(yīng)該全長表達(dá)還是部分表達(dá)？
是否應(yīng)該標(biāo)記蛋白質(zhì)？
如何純化蛋白質(zhì)？
……
在生產(chǎn)重組蛋白時，您必須做出很多決定。如果選擇明智，就能獲得高質(zhì)量的重組蛋白，后續(xù)實驗也更有可能成功。但如果決策失誤，就可能得不到所需的重組蛋白，或者重組蛋白的質(zhì)量和純度達(dá)不到要求。
此外，由于每種蛋白質(zhì)都不盡相同，因此沒有永遠(yuǎn)正確的答案。如何在如此眾多的生產(chǎn)策略中做出選擇，很大程度上取決于你打算表達(dá)的蛋白質(zhì)。
過去幾十年來，人們利用 DNA 重組技術(shù)從各種生物（病毒、古生菌、細(xì)菌和真核生物）中生產(chǎn)出了大量蛋白質(zhì)，并在實驗室中進(jìn)行了純化。一些研究人員總結(jié)了重組蛋白生產(chǎn)的幾個主要步驟，具體如下：
l 獲取 cDNA 并創(chuàng)建表達(dá)克隆
l 克隆
l 在合適的系統(tǒng)中表達(dá)蛋白質(zhì)
l 小規(guī)模試驗表達(dá)
l 蛋白純化
l 蛋白質(zhì)表征
目前，表達(dá)重組蛋白的系統(tǒng)有很多種，包括基于細(xì)胞的系統(tǒng)和無細(xì)胞系統(tǒng)?；诩?xì)胞的系統(tǒng)又可分為真核系統(tǒng)和原核系統(tǒng)。最常用的五種表達(dá)策略如下：
無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白
大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白
酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白
昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白
哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白
您可以點擊這些鏈接，獲取有關(guān)這些系統(tǒng)的更多信息。
所有表達(dá)系統(tǒng)的方法基本相似。其基本要求是：編碼相關(guān)蛋白質(zhì)的 DNA 序列、插入 DNA 序列的載體以及表達(dá)外來 DNA 序列的合適宿主。
盡管方法相似，表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用范圍卻各不相同。最常用的五種系統(tǒng)各有利弊。因此，在重組蛋白的生產(chǎn)中，表達(dá)系統(tǒng)的選擇是一個關(guān)鍵的考慮因素。選擇哪種表達(dá)系統(tǒng)主要取決于要表達(dá)的異源蛋白的性質(zhì)。
如果您對選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)仍有疑問，可參考本頁的表格 "哪種表達(dá)系統(tǒng)最適合您的實驗？"： cstxtech.com/Protein_Service.html
除了選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)，如何選擇合適的表達(dá)載體也是生產(chǎn)重組蛋白的一個難題。如果要表達(dá)具有生物活性的蛋白質(zhì)，還需要考慮其他因素。
影響重組蛋白表達(dá)的因素很多。例如，我們一般需要高產(chǎn)蛋白，但如果重組蛋白生產(chǎn)速度過快，可能會形成包涵體；許多重組蛋白需要糖基化等修飾，而糖基化只有真核細(xì)胞才有，因此在這種情況下，大腸桿菌等原核細(xì)胞不適合表達(dá)蛋白。
總的來說，重組蛋白生產(chǎn)是一項成熟的技術(shù)，市場上有多種系統(tǒng)可供選擇。但在重組蛋白的生產(chǎn)和純化過程中仍存在一些挑戰(zhàn)。
為了幫助你更好地了解重組蛋白是如何產(chǎn)生的，本文將介紹這些內(nèi)容：
什么是重組 DNA？
如何制造重組 DNA？
什么是重組蛋白？
如何生產(chǎn)重組蛋白？
1. 什么是重組 DNA？
要弄清什么是重組 DNA 以及如何利用重組 DNA 技術(shù)生產(chǎn)特定蛋白質(zhì)，首先應(yīng)該了解生物體內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)的相關(guān)知識。
對于任何生物體來說，蛋白質(zhì)都是構(gòu)成機(jī)體并發(fā)揮重要功能的最重要物質(zhì)之一。例如，人之所以能夠消化食物，是因為消化道分泌消化酶，將食物中的大分子分解成可以被人體吸收的小分子。所有這些酶都是蛋白質(zhì)。
自從 DNA 螺旋結(jié)構(gòu)于 1953 年被發(fā)現(xiàn)以來，人們對遺傳原理進(jìn)行了廣泛的研究?，F(xiàn)在，人們已經(jīng)清楚地認(rèn)識到，蛋白質(zhì)是由 DNA 通過兩個步驟制造出來的。第一步稱為轉(zhuǎn)錄，即從 DNA 生成 mRNA。下一步是翻譯，由 mRNA 生成蛋白質(zhì)。換句話說，DNA 序列提供了制造特定蛋白質(zhì)的指令。因此，基因表達(dá)實際上與蛋白質(zhì)表達(dá)具有相同的含義。
圖 1 基因表達(dá)重組 DNA（rDNA）是由兩個或多個 DNA 序列組合而成的 DNA 鏈?；蛑亟M是一個自然發(fā)生的過程。這一過程也可以為各種目的進(jìn)行人工操作，這就是所謂的 DNA 重組技術(shù)。利用 DNA 重組技術(shù)，科學(xué)家能夠創(chuàng)造出在正常情況和環(huán)境條件下不會自然存在的新 DNA 序列。由此產(chǎn)生的重組 DNA 被放入宿主細(xì)胞，在那里表達(dá)成一種新的蛋白質(zhì)，這就是所謂的重組蛋白。DNA 重組技術(shù)在生產(chǎn)用于制藥、醫(yī)療、農(nóng)業(yè)和其他用途的重組蛋白方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。
2. 如何制造重組 DNA？
圖 2 重組 DNA
DNA 重組技術(shù)還有其他名稱，包括 DNA 克隆、分子克隆和基因克隆。它們都是指將外來 DNA 轉(zhuǎn)移到生物體內(nèi)可自我復(fù)制的遺傳元件中，最終導(dǎo)致外來 DNA 的擴(kuò)增。目前，制造重組 DNA 的方法主要有以下三種：
① 轉(zhuǎn)化
將外來 DNA 片段切割并插入載體，通常是質(zhì)粒。然后，將產(chǎn)生的載體放入宿主細(xì)胞，如大腸桿菌，在其中表達(dá)外來 DNA 片段。細(xì)菌細(xì)胞吸收外來 DNA 的過程稱為轉(zhuǎn)化。
② 非細(xì)菌轉(zhuǎn)化
非細(xì)菌轉(zhuǎn)化不使用細(xì)菌作為宿主細(xì)胞。其中一個例子是 DNA 微注射，即把外來 DNA 直接注射到受體細(xì)胞的細(xì)胞核中。生物彈射法是一種利用高速微彈丸將外來 DNA 射入受體細(xì)胞的方法。
③ 噬菌體導(dǎo)入
噬菌體導(dǎo)入法是利用噬菌體將外來 DNA 轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，最終將含有外來 DNA 的噬菌體 DNA 植入宿主細(xì)胞的基因組。
3. 什么是重組蛋白？
重組蛋白是通過 DNA 重組技術(shù)人工制造的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)可用于許多領(lǐng)域，如診斷工具、疫苗、治療劑、洗滌劑、化妝品、食品生產(chǎn)和飼料添加劑等。僅僅從天然來源中分離蛋白質(zhì)無法滿足日益增長的蛋白質(zhì)需求。DNA 重組技術(shù)為獲取大量蛋白質(zhì)提供了一種更有效的方法。
這種方法有利有弊。例如，胰島素是一種對血糖起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的激素，糖尿病患者的胰島素會減少，而 DNA 重組技術(shù)已經(jīng)生產(chǎn)出了胰島素，挽救了許多人的生命。此外，DNA 重組技術(shù)還可以操縱相關(guān)蛋白質(zhì)的特性。從這些方面來看，DNA 重組技術(shù)和重組蛋白都是有益的。然而，人們對使用重組 DNA 技術(shù)的安全性和倫理道德仍有擔(dān)憂。
4. 如何生產(chǎn)重組蛋白？
重組蛋白的生產(chǎn)曾經(jīng)是專家的領(lǐng)域。現(xiàn)在，由于簡單的商業(yè)化系統(tǒng)的發(fā)展，重組蛋白的生產(chǎn)已經(jīng)成為一項非常成熟和廣泛的技術(shù)。在重組蛋白的生產(chǎn)過程中，仍然存在的一個挑戰(zhàn)是，你將面臨一系列令人困惑的選擇。
應(yīng)該使用哪種系統(tǒng)來表達(dá)蛋白質(zhì)？
使用哪種表達(dá)載體？
蛋白質(zhì)應(yīng)該全長表達(dá)還是部分表達(dá)？
是否應(yīng)該標(biāo)記蛋白質(zhì)？
如何純化蛋白質(zhì)？
……
在生產(chǎn)重組蛋白時，您必須做出很多決定。如果選擇明智，就能獲得高質(zhì)量的重組蛋白，后續(xù)實驗也更有可能成功。但如果決策失誤，就可能得不到所需的重組蛋白，或者重組蛋白的質(zhì)量和純度達(dá)不到要求。
此外，由于每種蛋白質(zhì)都不盡相同，因此沒有永遠(yuǎn)正確的答案。如何在如此眾多的生產(chǎn)策略中做出選擇，很大程度上取決于你打算表達(dá)的蛋白質(zhì)。
過去幾十年來，人們利用 DNA 重組技術(shù)從各種生物（病毒、古生菌、細(xì)菌和真核生物）中生產(chǎn)出了大量蛋白質(zhì)，并在實驗室中進(jìn)行了純化。一些研究人員總結(jié)了重組蛋白生產(chǎn)的幾個主要步驟，具體如下：
l 獲取 cDNA 并創(chuàng)建表達(dá)克隆
l 克隆
l 在合適的系統(tǒng)中表達(dá)蛋白質(zhì)
l 小規(guī)模試驗表達(dá)
l 蛋白純化
l 蛋白質(zhì)表征
目前，表達(dá)重組蛋白的系統(tǒng)有很多種，包括基于細(xì)胞的系統(tǒng)和無細(xì)胞系統(tǒng)?；诩?xì)胞的系統(tǒng)又可分為真核系統(tǒng)和原核系統(tǒng)。最常用的五種表達(dá)策略如下：
無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白
大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白
酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白
昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白
哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白
您可以點擊這些鏈接，獲取有關(guān)這些系統(tǒng)的更多信息。
圖 3 在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)重組蛋白
所有表達(dá)系統(tǒng)的方法基本相似。其基本要求是：編碼相關(guān)蛋白質(zhì)的 DNA 序列、插入 DNA 序列的載體以及表達(dá)外來 DNA 序列的合適宿主。
盡管方法相似，表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用范圍卻各不相同。最常用的五種系統(tǒng)各有利弊。因此，在重組蛋白的生產(chǎn)中，表達(dá)系統(tǒng)的選擇是一個關(guān)鍵的考慮因素。選擇哪種表達(dá)系統(tǒng)主要取決于要表達(dá)的異源蛋白的性質(zhì)。
如果您對選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)仍有疑問，可參考本頁的表格 "哪種表達(dá)系統(tǒng)最適合您的實驗？"： cstxtech.com/Protein_Service.html
除了選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)，如何選擇合適的表達(dá)載體也是生產(chǎn)重組蛋白的一個難題。如果要表達(dá)具有生物活性的蛋白質(zhì)，還需要考慮其他因素。
影響重組蛋白表達(dá)的因素很多。例如，我們一般需要高產(chǎn)蛋白，但如果重組蛋白生產(chǎn)速度過快，可能會形成包涵體；許多重組蛋白需要糖基化等修飾，而糖基化只有真核細(xì)胞才有，因此在這種情況下，大腸桿菌等原核細(xì)胞不適合表達(dá)蛋白。
總的來說，重組蛋白生產(chǎn)是一項成熟的技術(shù)，市場上有多種系統(tǒng)可供選擇。但在重組蛋白的生產(chǎn)和純化過程中仍存在一些挑戰(zhàn)。
