見微知著——外泌體再掀生命科學熱潮

利劍出鞘——華美高效率提取“納米膠囊”
 

美國抗衰老醫(yī)學研究會主席 Ronald Klatz 博士（抗衰老臨床醫(yī)學的先驅和主要權威人士之一）曾表示：「外泌體是干細胞技術的下一個發(fā)展方向」。

外泌體于1983年首次在體外培養(yǎng)的綿羊紅細胞上清液中發(fā)現(xiàn)且能被多種細胞分泌，當時外泌體的發(fā)現(xiàn)并沒有引起太多關注，被認為僅僅是成熟的紅細胞的廢物。

2013年，外泌體因諾貝爾醫(yī)學獎而被眾人知曉，也因此將外泌體研究推向了新高潮。外泌體在體液中廣泛存在及易獲得性等特點被譽為液體活檢"新秀"，成為疾病的精確診斷和治療研究的熱點。

外泌體是什么

外泌體（Exosomes）是一種能被機體內大多數(shù)細胞分泌的直徑大約為30-150 nm 的具有脂質雙層膜的微小膜泡，它廣泛存在并分布于血清、血漿、唾液、尿液、腦脊液和乳液等多種體液中。

 

外泌體攜帶和傳遞重要的信號分子，包含細胞溶質蛋白、參與細胞內信號轉導的蛋白、各種代謝酶、熱休克蛋白和四跨膜蛋白及特殊蛋白質，參與細胞活動的重要調控，形成了一種全新的細胞間信息傳遞系統(tǒng)。其影響細胞的生理狀態(tài)并與多種疾病的發(fā)生與進程密切相關，有望成為多種疾病的早期診斷標志物。

 

外泌體的表面marker主要有CD9、CD63、CD81、PKM、ENO1、TSG101、熱休克蛋白家族等。其中脂質雙分子層中含有豐富的Phosphatidylserine。

 

▲圖片來源：Exosomes:Fundamental Biology and Roles in Cardiovascular Physiology

 

外泌體研究熱潮不減

通過長久以來不斷進化，大自然創(chuàng)造并優(yōu)化了這些“納米膠囊”，用于在人體各組織間傳遞分子。如今，外泌體在生物技術方面的潛力受到了重視。

 

外泌體研究已經成為近年來SCI期刊和基金資助的雙熱點。

 

近年來外泌體相關研究駛入快車道，高分文章更是頻頻發(fā)表。據(jù)統(tǒng)計，Pubmed收錄的外泌體研究相關文章數(shù)量呈逐年遞增態(tài)勢。2020年文章量高達4277篇，較2019年增長近32%。而2021年上半年文章量已累計近3000篇，一路高歌猛進，呈現(xiàn)暴風增長。

(來源：Pubmed)
 

而美國資助基金的外泌體研究項目迅速增加，目前已資助"外泌體"課題達5563項。其中正在資助的470項課題中，外泌體研究涉及神經系統(tǒng)、細胞外基質、mRNA、干細胞、T細胞、癌癥、免疫、病毒感染、心血管疾病及HIV感染、囊性纖維化、敗血癥等廣泛領域。

 

制藥巨頭扎堆 瞄準外泌體黃金賽場

在資本的助力下，外泌體在治療和診斷方向的應用也從實驗室的研究階段迅速推進，迎來了產業(yè)化合作新浪潮，成為下一個群雄角逐的黃金賽場。外泌體產業(yè)在歐美日已蓬勃發(fā)展，迄今為止，全球約有40多家外泌體治療和診斷的公司。

2020年6月份，禮來、武田、拜耳宣布了與外泌體公司高達20億美元的交易。其中，禮來與英國Evox Therapeutics 簽署了一項價值 12 億美元的合作協(xié)議，未來雙方將利用Evox專有的外泌體藥物遞送平臺，開發(fā)RNA干擾和反義寡核苷酸藥物有效遞送載體，用于神經系統(tǒng)疾病的治療。

今年2月18日，位于英國的Evox Therapeutics從OrbiMed和谷歌風投籌集了6920萬英鎊（約9540萬美元），以推進其外泌體療法進入臨床試驗，專注于可用裝載蛋白質或RNA的外泌體治療的罕見疾病。

 

全球許多生物技術公司競相開發(fā)外泌體，例如Exosomics、Carmine Therapeutics、Vesigen Therapeutics、Mantra Bio和Aruna Bio等。近年來，很多國際制藥巨頭也紛紛投入這個領域來，羅氏（Roche）、武田、禮來已經分別與擁有這一創(chuàng)新技術平臺的公司達成多項高額合作，開發(fā)外泌體靶向療法。在投資者日益增加的資金支持的刺激下，該領域或將在未來幾年掀起一波熱潮。希望隨著研究的開展和技術的進步，外泌體作為藥物載體的研究可以取得快速的進展和新的突破。

 

外泌體市場/臨床應用

作為液體活檢領域的"三大標桿"之一，外泌體被認為是細胞間通訊、疾病診斷和預后循環(huán)生物標志物的重要載體，外泌體通過其攜帶的脂質、核酸、蛋白質、miRNA等來調節(jié)受體細胞的生物學活性，從而參與機體免疫應答、細胞遷移、腫瘤侵襲、抗原提呈等生物學過程。大量的證據(jù)表明外泌體及其內容物具有成為新型診斷標志物的潛能，在臨床和治療方面展現(xiàn)出了極具前景的研究價值。

外泌體在腫瘤中的應用前景非常廣闊。在液體活檢層面，外泌體相對易于獲取，攜帶足夠的生物信息，因此能夠攜帶腫瘤早期標志物信息，提供早期診斷的機會。對于中晚期患者而言，外泌體能夠用于治療標志物預測，幫助臨床選擇治療方案，同時在治療過程中提供動態(tài)監(jiān)控，幫助更好地獲益。

外泌體與細胞膜融合可將所攜帶的物質和信號傳遞到受體細胞并改變其生物學功能，因此，外泌體是納米藥物遞送或基因治療的潛在載體。也可以將外泌體作為藥物遞送的媒介，為其構建靶向性，使其用于遞送治療劑，從而擴展現(xiàn)有精準治療的給藥方式。

前期研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可自發(fā)富集于肝臟，因此，載藥外泌體在治療肝臟相關疾病如原位肝癌、肝衰竭、肝纖維化和脂肪肝等疾病方面具有巨大的應用前景。自然分泌的外泌體分離純化直接作為藥物的潛力有限，但是，將自然的外泌體分泌所需組分摻入合成脂質體或納米顆粒中，并且使用可控程序組裝后的工程化外泌體模擬物在藥學上擁有更大的應用潛力。

 

外泌體分離提取

研究外泌體內涵成分的前提是對其進行高質量的提取，由于外泌體粒徑較小且與多種其他生物分子混合在一起，導致其分離純化困難，阻礙了對其的進一步研究。

近年來，研究人員根據(jù)外泌體理化性質研發(fā)了多種分離純化方法：常用的有超速離心法、密度梯度超速離心法、超濾法、多聚物沉淀法（PEG）、免疫磁珠法、試劑盒分離法等。

而對于外泌體的分離，首先要關注外泌體的提取質量，包括純度、囊泡狀態(tài)、得率及重復性等方面的評估，然后才是技術路線的選擇。

 

 

⊙超速離心法是最常用的外泌體純化手段，目前已發(fā)表文獻引用最多的方法，采用低速離心、高速離心交替進行，可分離到大小相近的囊泡顆粒。

優(yōu)點：無需特殊試劑，操作簡便，適合大批量樣本。

缺點：耗時耗力，純度相對較低，回收率不穩(wěn)定，重復離心會一定程度損傷外泌體，設備要求高。

⊙密度梯度超速離心法是在超速離心力作用下，使蔗糖溶液形成從低到高連續(xù)分布的密度階層，是一種區(qū)帶分離法。通過密度梯度離心，樣品中的外泌體將在1.13-1.19g/mL的密度范圍富集。

優(yōu)點：純度相對較高，適合大批量樣本。

缺點：步驟繁瑣，耗時，回收率不穩(wěn)定，重復離心會一定程度損傷外泌體，設備要求高。

⊙超濾法是將溶劑及小分子物質過濾到膜的另一側，而將相對大分子物質截留在超濾膜上，以達到分離的目的。

優(yōu)點：簡單高效，不影響外泌體的完整性。

缺點：外泌體可能會阻塞過濾孔，導致膜的壽命減短，分離效率和純度較低。此外，截留在膜上的外泌體間也會發(fā)生粘附，導致產量降低。

⊙多聚物沉淀法根據(jù)化合物與外泌體的理化特性，利用共沉淀或者反向篩選的方式對外泌體進行分離純化。

優(yōu)點：操作簡單、耗時短、無設備限制。

缺點：純度較低，存在假陽性（雜蛋白較多或一些難以去除的聚合物），機械力或化學添加物對外泌體產生破壞，存在于分離物中的聚合物也可能會干擾下游分析等。

⊙抗體親和（磁珠）法利用包被單克隆抗體的磁珠結合外泌體，外泌體表面有其特異性標記物（如CD63、CD9蛋白），用包被抗標記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結合，即可將外泌體吸附并分離出來。

優(yōu)點：純度較高，特異性和重復性好、操作簡便、無設備限制。

缺點：效率和回收率較低，僅能捕獲表達特定抗原的目標外泌體，外泌體生物活性易受pH和鹽濃度影響，囊泡完整性影響較大。

 

綜上所述，現(xiàn)有技術的方法提取到的外泌體，缺陷在于：收率較低，耗時長、純度不高，外泌體囊泡不完整等。

 

鑒于上述問題，武漢華美生物工程有限公司研發(fā)的外泌體提取試劑盒提供了一種簡單可靠的方法可從細胞培養(yǎng)上清液，血清，血漿，乳液，尿液，唾液，酵母，植物中提取完整的外泌體。該產品提取的外泌體囊泡適用于下游的電鏡分析、NTA分析、納米流式（NanoFCM）分析、Western Blot、熒光定量（qPCR）和高通量測序等應用。

該試劑盒通過蛋白親和的方式分離外泌體，無需超速離心即可實現(xiàn)高效率地從各種類型樣本中提取高純度、囊泡結構完整的外泌體，具有簡便、穩(wěn)定、易操作的優(yōu)點：

• 適用于各種樣品類型(細胞培養(yǎng)上清液，血清，血漿，乳液，尿液，唾液、酵母、植物)

• 適用于各種細胞上清液中外泌體的分離提取(A375，HEPG2，PC-3，Hela，U87，MG63等)

• 所提取的外泌體囊泡結構完整，呈球形或碟形，顆粒均勻

• 高產量，單次提取，可獲得3*1011 個/mL 外泌體囊泡

• 操作簡單無設備要求（不需要超速離心）

 

 

武漢華美生物工程有限公司(cstxtech.com)成立于2007年12月，是一家集科研、生產、銷售為一體的生物高新技術企業(yè)。并形成了以CUSABIO為品牌的ELISA試劑盒、蛋白、抗體等多種優(yōu)質產品，遠銷歐美日德等九十多個國家。

2018年3月31日，華美生物兄弟公司生之源與2013年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎得主蘭迪·謝克曼教授舉行簽約儀式，并建立諾貝爾獎工作站。此舉大大助推了華美外泌體相關科研產品的研究和生產！

華美生物研發(fā)的外泌體(Exosome)提取試劑盒廣泛兼容各種樣本類型和各種細胞上清液(如A375，HEPG2，PC-3，Hela，U87，MG63等)，為廣大生物醫(yī)學科研學者提供高質量的產品與技術服務。

 

外泌體研究吸引著生命科學各個領域的科學家。華美CUSABIO提供外泌體提取試劑盒，將助力研究人員探秘其功能，擴大其醫(yī)學應用。
 

☆外泌體相關標志物精品抗體：

GAPDH Monoclonal Antibody (CSB-MA000071M0m)

CD9 Monoclonal Antibody (CSB-MA004969A0m)

CD63 Monoclonal Antibody (CSB-MA004950A0m)

ENO1 Monoclonal Antibody (CSB-MA007670A0m)

PKM Monoclonal Antibody (CSB-MA018072A0m)

 

 

外泌體未來展望

外泌體爆炸性研究活動已經慢慢演變?yōu)榉肿俞t(yī)學的快速發(fā)展。外泌體在臨床醫(yī)學中有十分光明的應用前景，主要是因為它們含有豐富的生物標志物，可用于監(jiān)測臨床狀態(tài)、診斷疾病、治療反應、疾病進展等。重要且有影響力外泌體研究領域會隨著高效率的外泌體分離技術的發(fā)展而發(fā)展。

外泌體可作為生物標志物用于疾病的診斷，也推動了以外泌體為靶標的治療方法研究或將外泌體本身用作治療工具的研究。將外泌體用作治療工具的臨床研究正在開展之中，其目的是研究患者自身MSC分泌外泌體或健康捐贈者體內外泌體用于治療的安全性和有效性。這個趨勢下，外泌體用作藥物輸送系統(tǒng)作為基因治療的潛在載體有可能變得更加普遍。外泌體在癌癥中同時發(fā)揮免疫激活和免疫抑制功能，外泌體腫瘤免疫療法有望誕生抗癌疫苗。

外泌體作為疾病診斷標志物的潛在應用依賴于基于外泌體的藥物遞送系統(tǒng)的技術突破，理論上能夠從外泌體中檢測到DNA序列變異、RNA的表達變化、蛋白質變化等。要將其用于臨床治療，外泌體的大規(guī)模工業(yè)化生產還面臨很大的挑戰(zhàn)。首先，對外泌體的具體合成機制、功能了解并不是非常詳細。其次，存在外泌體分離技術、分離量、及檢測技術的挑戰(zhàn)，外泌體在腫瘤學中的應用還需要加強和深入研究。然而，雖然當前外泌體生物學仍然不成熟，但越來越多的興趣和資金投入必將加速外泌體基礎研究進展和臨床轉化。

 

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