自然殺傷細(xì)胞的表面標(biāo)記

1. 自然殺傷細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)

關(guān)于NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)，目前主要有兩種方法：滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)方式和純因子細(xì)胞培養(yǎng)方式。

• 滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)方式：滋養(yǎng)層細(xì)胞（人腫瘤細(xì)胞，即人白血病K562細(xì)胞）是具有不分裂不增殖但仍保持代謝活性的細(xì)胞。該細(xì)胞細(xì)胞膜表面穩(wěn)定表達(dá)的多種細(xì)胞因子可促進(jìn)外周血單核細(xì)胞中的自然殺傷細(xì)胞的定向激活和擴(kuò)增。
• 純因子細(xì)胞培養(yǎng)方式：使用相應(yīng)的細(xì)胞因子來(lái)刺激單個(gè)核細(xì)胞，使其向NK細(xì)胞方向發(fā)展，并配合相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，使NK細(xì)胞大量增殖。目前添加的細(xì)胞因子主要有IL-2、IL-7、IL-15、IL-18，其中IL-2和IL-15的作用尤為明顯。該方法相比較滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)方式而言，有較高的安全性。

2. NK細(xì)胞表面標(biāo)志物

所有的細(xì)胞都有其特有的標(biāo)記，這些標(biāo)記可以是蛋白質(zhì)、脂類、糖基化等，它們可以用于區(qū)分不同的細(xì)胞類型。

細(xì)胞標(biāo)志物既可以在細(xì)胞外表達(dá)，也可以作為細(xì)胞內(nèi)分子表達(dá)。

很長(zhǎng)一段時(shí)間，NK細(xì)胞被認(rèn)為缺乏表面抗原，被稱為“裸淋巴細(xì)胞”?，F(xiàn)在，人們已經(jīng)知道NK細(xì)胞表達(dá)大量受體。不同種屬中，NK細(xì)胞的表面標(biāo)志物存在一些差異。人類和小鼠中的NK細(xì)胞表達(dá)表面標(biāo)記差異如下：

人類：CD16（FcγRIII）, CD56

小鼠：CD49b (clone DX5)

此外，高達(dá)80％的人類NK細(xì)胞也表達(dá)CD8。以下是一些NK細(xì)胞的一些標(biāo)志物。

NK細(xì)胞標(biāo)志物可分為兩種類型：細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記和細(xì)胞外標(biāo)記。

2.1 細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記

顆粒酶B（Granzyme B）

穿孔素（Perforin）

2.2 細(xì)胞外標(biāo)記

2.2.1 CD16

CD16是自然殺傷(NK)細(xì)胞表達(dá)的表面受體，NK細(xì)胞上的CD16是完全跨膜的，具有ITAM的細(xì)胞質(zhì)尾巴，而不是通過(guò)GPI錨連接。它是一種免疫球蛋白Fc受體，它能夠觸發(fā)細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，允許NK細(xì)胞介導(dǎo)抗體依賴性殺傷(ADCC)^[1]。NK細(xì)胞CD16的表達(dá)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)亞基zeta相關(guān)，CD16激活NK細(xì)胞導(dǎo)致zeta酪氨酸磷酸化。

2.2.2 CD56

CD56，也稱為神經(jīng)細(xì)胞粘附分子，它是一種200-220 kDa的糖蛋白，主要在人NK細(xì)胞和少數(shù)介導(dǎo)MHC的T淋巴細(xì)胞上表達(dá)。CD56具有五個(gè)胞外遠(yuǎn)端IGSF結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)近端纖連蛋白樣III結(jié)構(gòu)域。CD56能夠在兩個(gè)細(xì)胞之間或在同一細(xì)胞上進(jìn)行同源二聚化。它為突觸生長(zhǎng)和神經(jīng)肌肉相互作用提供重要信號(hào)。CD56對(duì)NK細(xì)胞的作用可能是粘附。

根據(jù)NK細(xì)胞表面分化抗原56（Cluster of differentiation, CD）密度的不同，人NK細(xì)胞可以分為CD56 ^dim 和CD56 ^bright 2個(gè)亞群。CD56 ^dim具有殺傷靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，是NK細(xì)胞的主要組成，約占其總數(shù)的（90-95）%；CD56 ^bright細(xì)胞以分泌免疫調(diào)控因子為主，大約占NK細(xì)胞的（5-10）%。

2.2.3 CD94

CD94在NK細(xì)胞的表面以與NKG2A同型或異型的形式展示。一旦CD94-NKG2A復(fù)合物與配體結(jié)合，它對(duì)NK細(xì)胞具有很強(qiáng)的抑制能力。盡管CD94和二聚體具有不同的作用機(jī)理，但是它們也具有抑制能力。它可能與逃避NK細(xì)胞的病毒有關(guān)。

2.2.4 CD160

在細(xì)胞毒性NK細(xì)胞中，CD160以GPI或跨膜的形式存在，它主要表達(dá)于NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性亞群（CD56^dim / CD16 ⁺）中。此外，它也在γ/δT細(xì)胞和一小部分含有顆粒酶和穿孔素的CD8^LightαβT上表達(dá)。它也可以在小腸上皮的CD8 ⁺ T中表達(dá)。

在NK細(xì)胞中，CD160可增強(qiáng)細(xì)胞激活和細(xì)胞毒性，并激活細(xì)胞因子IFN-γ，IL-6，IL-8和TNF-α的分泌。

2.2.5 NK細(xì)胞的其他表面標(biāo)志物

CD2：CD2是自然殺傷細(xì)胞的表面蛋白^[2]。它是一種NK細(xì)胞觸發(fā)受體，大小為50-55 kDa，在T細(xì)胞上也有表達(dá)。當(dāng)與腫瘤細(xì)胞上的配體結(jié)合時(shí)，CD2家族成員調(diào)節(jié)自然殺傷（NK）細(xì)胞的裂解活性和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

2B4 (CD244)：是免疫球蛋白超家族分子CD2子集的成員，在自然殺傷（NK）細(xì)胞和其他白細(xì)胞上表達(dá)^[3]。

BAT：它可以將NK細(xì)胞與T細(xì)胞和B細(xì)胞的其他已知子集區(qū)分開(kāi)^[4]。

CD45：細(xì)胞表面磷酸酶CD45在NK細(xì)胞發(fā)育和激活受體的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，是誘導(dǎo)NK細(xì)胞反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵酶^[5]。

CD57/HNK1：CD57是自然殺傷(NK)細(xì)胞標(biāo)志物，它可與包括外周血中所有自然殺傷(NK)細(xì)胞在內(nèi)的人類白細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)。

CD69：CD69是NK細(xì)胞激活標(biāo)記物[6]。它可形成二聚體表達(dá)于活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和血小板表面，是一類與自然殺傷細(xì)胞活化抗原家族相關(guān)的II型膜糖蛋白。它在NK細(xì)胞功能中起著關(guān)鍵作用，有助于維持NK細(xì)胞的激活。

CD107a：鑒定天然殺傷細(xì)胞活性的功能標(biāo)記^[7]。

CD161：NK細(xì)胞激活標(biāo)記物^[6]。

CD335/NKp46：一種參與人NK細(xì)胞活化的細(xì)胞表面受體。由NK細(xì)胞表達(dá)的主要?dú)荏w。

CD314（KLRK1）：在自然殺傷(NK)細(xì)胞中表達(dá)，激活殺傷細(xì)胞(NK)的先天免疫反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞毒性活動(dòng)。參與NK細(xì)胞介導(dǎo)的骨髓移植排斥反應(yīng)?？赡軐?duì)NK細(xì)胞的分化和存活起調(diào)節(jié)作用。

HP (Helix pomatia) Receptors：在NK細(xì)胞上檢測(cè)到的第一個(gè)簡(jiǎn)單可靠的標(biāo)記物，可能對(duì)純化這種細(xì)胞類型有用。

LAT (linker for activation of T cells)：LAT是36-38 kDa的完整膜蛋白，在T細(xì)胞活化中起重要作用，可作為T(mén)細(xì)胞，NK細(xì)胞，肥大細(xì)胞和巨核細(xì)胞的新型免疫組織化學(xué)標(biāo)記。

Ly24 (Pgp-1)：小鼠自然殺傷細(xì)胞在其表面表達(dá)Ly24 (Pgp-1)標(biāo)記物。

Ly49H：是C57BL/6（B6）小鼠特有的NK細(xì)胞活化受體。

NKG2A and NKp80：恒河猴和豬尾猴中特定的自然殺傷細(xì)胞標(biāo)記。

3. NK細(xì)胞表面受體的功能

NK細(xì)胞主要來(lái)源于骨髓淋巴樣干細(xì)胞，約占體內(nèi)淋巴細(xì)胞的10%，主要分布于外周血和外周淋巴組織^[8]。

根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同，NK細(xì)胞表面受體可分為免疫球蛋白超家族與C型凝集素超家族。根據(jù)功能的不同，NK細(xì)胞表面受體可分為殺傷細(xì)胞活化受體和殺傷細(xì)胞抑制受體。NK細(xì)胞表面表達(dá)的抑制性受體維持NK細(xì)胞對(duì)宿主自身正常組織細(xì)胞的耐受，NK細(xì)胞表面表達(dá)的活化性受體可與靶細(xì)胞表面相應(yīng)配體結(jié)合，激發(fā)NK細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用?；罨允荏w和抑制性受體所介導(dǎo)的信號(hào)的平衡影響NK細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷活性^[9]。

4. 抗腫瘤免疫機(jī)制

NK細(xì)胞主要通過(guò)兩種方式發(fā)揮其抗腫瘤的功能：免疫清除和免疫監(jiān)視。

免疫清除主要包括以下3個(gè)機(jī)制：

• 通過(guò)釋放細(xì)胞毒性顆粒殺傷腫瘤細(xì)胞。NK細(xì)胞可釋放穿孔素和顆粒酶，這兩者通過(guò)改變靶細(xì)胞滲透壓、激活凋亡酶相關(guān)系統(tǒng)使腫瘤細(xì)胞裂解凋亡。
• 通過(guò)細(xì)胞表面合成的蛋白激活靶細(xì)胞凋亡系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞?；罨腘K細(xì)胞表達(dá)FasL和TNF-α，這兩種蛋白與腫瘤細(xì)胞表面相應(yīng)的受體Fas(CD95)、TNFR-1分別結(jié)合，形成Fas三聚體和TNF-R三聚體，啟動(dòng)靶細(xì)胞的凋亡系統(tǒng)，從而殺傷靶細(xì)胞。
• 通過(guò)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)殺傷靶細(xì)胞。

除NK細(xì)胞自身對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用外，活化的NK細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子，如TNF、IFN等協(xié)同其抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞。

5. NK細(xì)胞與腫瘤

NK細(xì)胞作為機(jī)體固有免疫系統(tǒng)中重要的組成部分，在腫瘤免疫方面發(fā)揮重要作用。NK細(xì)胞表面活化受體和抑制受體的表達(dá)決定其抗腫瘤能力的強(qiáng)弱。NK細(xì)胞在抑制肺癌、乳腺癌、大腸癌等惡性腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移方面有一定的意義。

5.1 肺癌

NK細(xì)胞和穿孔素介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用對(duì)于肺癌的預(yù)防有一定的作用^[10]。顆粒酶B、穿孔素的表達(dá)減少與肺癌之間有一定的關(guān)聯(lián)^[11]。

NK細(xì)胞的免疫治療研究發(fā)現(xiàn)活化NK細(xì)胞可以抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。肺癌的發(fā)生與NK細(xì)胞數(shù)量的減少及其活性的降低密切相關(guān)。因此提高NK細(xì)胞活性、增加NK細(xì)胞數(shù)量是防治肺癌發(fā)生發(fā)展的重要免疫治療手段。

5.2 乳腺腫瘤

乳腺腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移同樣與NK細(xì)胞的活性密切相關(guān)。乳腺癌患者NK細(xì)胞活性明顯下降，而且其表面活化性受體表達(dá)受到限制，而抑制性受體水平明顯升高^[12]。

5.3 白血病

白血病患者NK細(xì)胞中抑制性受體NKG2A的表達(dá)顯著升高，而活化性受體NKP46明顯降低，這使得NK細(xì)胞殺傷活性降低^[13]。通過(guò)調(diào)節(jié)NK細(xì)胞表面受體的表達(dá)可以改變其活性，增強(qiáng)其免疫功能。

6. NK細(xì)胞在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用

根據(jù)NK細(xì)胞的抗腫瘤免疫機(jī)制，可應(yīng)用相應(yīng)的方法對(duì)腫瘤進(jìn)行治療。

6.1 抗體介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用

它是基于抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(ADCC)而形成的治療方法。它能夠靶向殺傷腫瘤細(xì)胞或者增強(qiáng)NK細(xì)胞的ADCC作用。

例如，在CD137單克隆抗體的作用下，NK細(xì)胞的CD137表達(dá)提高，作為活化信號(hào)分子，它使得NK細(xì)胞在脫顆粒、分泌IFN-γ和抗腫瘤活性方面能力明顯增強(qiáng)^[14]。

CCR4單抗提高NK細(xì)胞的ADCC作用^[15]。

6.2 供受者KIR-HLA不匹配與NK細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)

NK細(xì)胞既能對(duì)體內(nèi)正常細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受，又可以殺傷腫瘤細(xì)胞。

對(duì)于正常細(xì)胞，NK細(xì)胞通過(guò)表面抑制型KIR受體識(shí)別細(xì)胞的HLA-Ⅰ類分子，轉(zhuǎn)導(dǎo)殺傷抑制性信號(hào)，阻止NK細(xì)胞對(duì)正常細(xì)胞的殺傷。對(duì)于腫瘤細(xì)胞，其表面缺乏HLA-Ⅰ類信號(hào)分子，容易被NK細(xì)胞識(shí)別并攻擊。供受者KIR-HLA不匹配可引起NK細(xì)胞的異源反應(yīng)性，激活供者NK細(xì)胞殺傷受者細(xì)胞。

這種方法在應(yīng)用于治療髓性白血病和淋巴細(xì)胞白血病時(shí)，能有效增強(qiáng)移植物抗白血病效應(yīng)^[16]，提高患者的生存率。在腎癌、胃癌、腸癌、卵巢癌等實(shí)體瘤治療中，也取得較好的治療效果^[17]。