&#4326；WB之成功全攻略&#4326；

何為蛋白印跡（WB）

蛋白印跡也稱作免疫印跡，是一種被廣泛應(yīng)用并得到公認(rèn)的技術(shù)，用于檢測(cè)細(xì)胞或組織提取物中的蛋白表達(dá)水平。
這一技術(shù)利用抗體與特定待檢測(cè)蛋白的結(jié)合，測(cè)定生物樣本中的蛋白水平?？贵w與其靶點(diǎn)蛋白表位的精確結(jié)合可用于檢測(cè)蛋白質(zhì)中具有高度特異性的氨基酸序列。
一句話講完WB：就是抗原抗體反應(yīng)！

Western Blot 可以：
1.從蛋白質(zhì)混合物中檢出目標(biāo)蛋白質(zhì)；
2.定量或定性確定細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)情況；
3.用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA相互作用后續(xù)分析。

▲WB操作關(guān)鍵步驟

以下，會(huì)從關(guān)鍵步驟入手，我們將給出試劑和實(shí)驗(yàn)過程的建議，逐一介紹每個(gè)步驟中的一些關(guān)鍵注意點(diǎn)以及給出對(duì)應(yīng)優(yōu)化后的圖表，供大家參考

一、裂解產(chǎn)物制備
1.組織裂解
常見破碎組織的方法： 機(jī)械法、勻漿法、超聲波破碎解、研磨法，反復(fù)凍融法等；
實(shí)驗(yàn)室常用的破碎方法：
1.超聲波；
2.電動(dòng)研磨；
3.磁珠破碎法。（注意磁珠高速旋轉(zhuǎn)時(shí)產(chǎn)生的熱量比較多，需提前把機(jī)器放在冰箱制冷）
以上主要注意發(fā)熱引起的蛋白變性和聚集，操作過程中盡量減少細(xì)節(jié)上的差異，這樣才能保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性比較一致。

2.細(xì)胞裂解
一般裂解液包含以下幾個(gè)組分:
1. 緩沖系統(tǒng)；
2. 鹽離子；
3. 離液劑；
4. 蛋白酶抑制劑；
5. 還原劑

▲根據(jù)目的蛋白選擇合適的裂解液 

▲常見蛋白酶磷酸酶抑制劑

二、凝膠電泳
1.加入足量的樣品和分子量大小標(biāo)記物
SDS-PAGE 根據(jù)蛋白電泳遷移率將其分離，遷移率是蛋白大小和電荷的函數(shù)。
我們建議在預(yù)制 Tris-Glycine 小孔膠上樣20-40μg 全細(xì)胞裂解液或100ng純化蛋白，根據(jù)目標(biāo)蛋白的表達(dá)量?jī)?yōu)化上樣量。
對(duì)于大分子量靶標(biāo)，我們建議采用 Tris-Acetate 凝膠和相關(guān)緩沖液。
應(yīng)在待測(cè)樣本附近的泳道始終加入分子量標(biāo)記物，作為參考點(diǎn)。
分子量標(biāo)記物（或梯狀條帶）是已知分子量的純化蛋白的混合物。
采用預(yù)染色標(biāo)記可以看見電泳過程中蛋白遷移的距離，隨后確認(rèn)經(jīng)電轉(zhuǎn)移至膜。
采用生物素標(biāo)記物可以看見膜上的梯狀條帶和抗體靶標(biāo)。

2.選擇合適的蛋白marker
預(yù)染蛋白marker應(yīng)用：
?實(shí)時(shí)監(jiān)控SDA-PAGE中的蛋白遷移
?檢驗(yàn)western轉(zhuǎn)膜效率
?對(duì)蛋白大小進(jìn)行初略鑒定
?呈彩色且轉(zhuǎn)膜效果好

▲電泳凝膠制備參考濃度

三、轉(zhuǎn)膜
1.濕轉(zhuǎn)移
把蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至膜上的濕轉(zhuǎn)移是指把濾紙-凝膠-膜-濾紙“三明治”完全浸入緩沖液中。使用此方法時(shí)，在浸沒的情況下通過電泳轉(zhuǎn)移至 0.2 μm 孔徑硝酸纖維素膜，在冷卻的含 20% 甲醇的轉(zhuǎn)移緩沖液中轉(zhuǎn)膜，70V，1.5小時(shí)。

2.半干轉(zhuǎn)移
把蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至膜上的半干轉(zhuǎn)移是指將浸滿緩沖液的濾紙-凝膠-膜-濾紙“三明治”系統(tǒng)，置于本應(yīng)干燥的陽極和陰極板上。
在這一系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)移在桌面上進(jìn)行，在室溫條件下約15-60分鐘。轉(zhuǎn)移低分子量和高分子量蛋白時(shí)這一系統(tǒng)均運(yùn)轉(zhuǎn)良好，相較于濕轉(zhuǎn)移所需緩沖液更少，但是在某些情況下會(huì)產(chǎn)生更高的背景染色。（轉(zhuǎn)膜時(shí)不離人，監(jiān)測(cè)電流電壓）

3.干轉(zhuǎn)移
把蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至膜的干轉(zhuǎn)移是指不額外加入緩沖液的系統(tǒng)，因?yàn)殛枠O和陰極板系統(tǒng)中含有緩沖液基質(zhì)。對(duì)于較大分子量蛋白，觀察到信號(hào)差異最大，表明轉(zhuǎn)移效率低。
（注意：在樣本量有限或待檢測(cè)蛋白低內(nèi)源水平的情況下，干轉(zhuǎn)移方法會(huì)限制您分析的靈敏度。）

▲Trans Blot

四、封閉
建議轉(zhuǎn)移之后迅速在 Tris-Buffered Saline (TBS) 中洗滌膜，以便移除殘留的轉(zhuǎn)移緩沖液，隨后在室溫條件下含5% 脫脂牛奶的 Tris Buffered Saline 和 Tween® 20 去污劑 (TBST)中封閉1小時(shí)。這一封閉步驟有助于降低非特異性一抗結(jié)合并降低背景。應(yīng)避免膜封閉時(shí)間過長(zhǎng)，因?yàn)檫@會(huì)掩蓋抗原表位，阻止抗體結(jié)合。封閉后在TBST 中洗滌5分鐘。

五、一抗、二抗孵育
1.加一抗與抗原結(jié)合
?一抗應(yīng)在含5% BSA 或5% 脫脂牛奶的 TBST 緩沖液中稀釋。
?一抗孵育時(shí)間會(huì)有很大的差別，具體取決于研究人員采用的操作流程。建議在4℃ 過夜孵育一抗。（過夜孵育提高抗體結(jié)合）
?免疫印跡操作流程的另一個(gè)存在差異的方面是洗滌和稀釋緩沖液。推薦抗體稀釋緩沖液和洗滌步驟使用TBST。(TBST 緩沖液產(chǎn)生更強(qiáng)的信號(hào))

2.加二抗與一抗的結(jié)合
?建議在含 5% 脫脂牛奶的 TBST 中稀釋二抗。
?因?yàn)槊撝Ｄ痰姆忾]要更強(qiáng)，所以基于 BSA 的稀釋比基于牛奶的稀釋產(chǎn)生的背景明顯更強(qiáng)。
?如果對(duì)免疫沉淀細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，考慮采用構(gòu)象或鏈特異性二抗，以避免 IgG 重鏈或輕鏈的信號(hào)。

這個(gè)步驟的成敗
關(guān)鍵看試劑質(zhì)量的好壞
用的抗體不到位
整個(gè)實(shí)驗(yàn)都白費(fèi)
有木有

華美抗體?成功助力

六、檢測(cè)
一般使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法或堿性磷酸酶AP-NBT/BICP顯色法。
1．HRP-ECL發(fā)光法：
將A、B發(fā)光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于A、B混合液滴上，熄燈至可見淡綠色熒光條帶（5min左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒，根據(jù)所見熒光強(qiáng)度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干，標(biāo)定Marker，進(jìn)行分析與掃描。

2．AP-NBT/BICP顯色法：
每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前將一片分裝在30個(gè) EP管中，每張3×9cm的膜取一管配成1ml即可。將PBST或TTBS洗滌過的膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物體（如報(bào)紙）遮擋光線，顯色20s后每10s觀察一次，至條帶明顯或有本底出現(xiàn)時(shí)將膜揭起置去離子水中漂洗后放濾紙上晾干即可觀察與掃描。背景深淺與一抗的質(zhì)量及二抗的量有關(guān)，當(dāng)然如果曝光時(shí)間長(zhǎng)達(dá)半小時(shí)，出現(xiàn)背景是正常的。

▲顯色
（干貨是不是很受用）
還想了解更多么
敬請(qǐng)期待~
下次為大家?guī)?br /> WB中的常見問題及解答
明明白白做實(shí)驗(yàn)
善其事前利其器
普通問題常規(guī)避
優(yōu)化成功沒問題
 

（如若有實(shí)驗(yàn)中需要了解的問題，歡迎留言哦）
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