Detergent的性質(zhì)及其在膜蛋白中的應用

1. 去垢劑的結(jié)構(gòu)

去垢劑屬于表面活性劑，應用廣泛，包括：聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）、包涵體的溶解、脂質(zhì)體的制備、膜蛋白溶解和活性結(jié)構(gòu)研究等。并且，去垢劑在體外研究中也可以作為模型膜。

去垢劑的功能與其結(jié)構(gòu)有關(guān)：去垢劑分子的極性親水部分被作為親水頭部基團（hydrophilic head group），而非極性疏水部分被作為尾巴（tail）。也有一些去垢劑是豆狀分子形狀(Figure 1B)，它們有極性和非極性的面，包括bile acid derivatives，例如CHAPS和CHAPSO。

2. 去垢劑的分類

根據(jù)去垢劑親水基團的不同可以將去垢劑分為離子型（陽離子or陰離子）、非離子型和兩性離子型。

離子型去垢劑包括十二烷基硫酸鈉（SDS）、N-月桂基肌氨酸(N-lauryl sarcosine)、CTAB等，能從膜中有效地提取蛋白。這些去垢劑能有效地破壞分子內(nèi)和分子間蛋白之間的相互作用，性質(zhì)苛刻，傾向于將蛋白變性。其中，膽酸鹽類（Bile acid salts），例如膽酸鈉(sodium cholate)和脫氧膽酸(deoxycholic acid)，也是離子型去垢劑，但它們的骨架由剛性類固醇組成，比直鏈離子去垢劑更溫和。

非離子型去垢劑包括麥芽糖苷（maltosides）、葡萄糖苷（glucosides）和聚氧乙烯二醇（polyoxyethylene glycols），特點是親水頭部基團不帶電荷。這些去垢劑溫和、非變性，破壞蛋白-脂質(zhì)和脂質(zhì)-脂質(zhì)相互作用。

兩性離子去垢劑包括Zwittergents，F(xiàn)os-Cholines，CHAPS/CHAPSO等，親水頭部基團包含正負電荷。這些去垢劑像非離子型去垢劑一樣是電中性的，但通常能像離子型去垢劑一樣破壞蛋白之間相互作用，因此溫和程度介于中間。大部分成功的膜蛋白NMR研究利用的兩性去垢劑，例如Fos-Choline 12。

3. 關(guān)于去垢劑的幾個概念

3.1 臨界膠束濃度（The critical micelle concentration，CMC）

當考慮去垢劑應用時，膠束化是一個關(guān)鍵現(xiàn)象。每一種去垢劑都有一個CMC值，當去垢劑濃度高于CMC時，單體自組裝成非共價聚集體，也叫膠束micelles。膠束化實際上不在一個單一濃度內(nèi)發(fā)生，而是在一個窄的濃度范圍內(nèi)發(fā)生。

當作用于膜蛋白時，一個經(jīng)驗法則是：去垢劑的工作濃度至少是2xCMC，而去垢劑:蛋白的重量比至少是4:1。當從原始膜中溶解膜蛋白時，去垢劑的工作濃度遠高于CMC，并且去垢劑與脂質(zhì)的摩爾比是10:1。因此CMC決定了需要向各種蛋白和膜制品中加入去垢劑的量 ^[2]。

去垢劑的CMC值并不是固定的，它會隨著溶液中pH，離子強度和溫度的改變發(fā)生變化 ^[3]。例如離子型去垢劑的CMC會隨著溶液中離子強度的增加而降低。

3.2 膠束化（Micellization）

膠束是溶液中去垢劑單體的聚集體，形成膠束的過程被稱為膠束化 ^[4]。去垢劑以膠束的形式與膜蛋白和膜相互作用，蛋白的溶解依賴于溶液中膠束的形成。膠束通常被認為有著“粗糙”的表面，是動態(tài)的結(jié)構(gòu)。膠束內(nèi)的去垢劑單體與溶液中游離的去垢劑單體快速交換。膜蛋白一旦被溶解，我們通常認為去垢劑分子在疏水跨膜域周圍形成環(huán)面。

4. 去垢劑在膜蛋白中的應用

4.1 去垢劑的替換或去除

可以有效溶解膜蛋白的去垢劑也可能不適宜做進一步的生物化學研究，這個時候需要將膜蛋白轉(zhuǎn)移到一個更合適的去垢劑溶液中。當組裝liposomes或nanodiscs時，需要去除去垢劑。當考慮替換或去除不需要的去垢劑時，CMC用來確定可用的方法。高CMC的去垢劑易通過透析除去，去垢劑溶液能通過透析稀釋到CMC值以下，此時膠束分解為單體，單體能容易地穿過透析膜。一般情況下，去垢劑溶液用超過200倍體積的不含去垢劑的緩沖透析幾天，中間幾次換液，例如Fos-Choline 12。低CMC去垢劑一般通過疏水珠吸附除去，例如DDM。還可以通過鎳柱純化，當膜蛋白結(jié)合到柱材料后，換含有另一種去垢劑溶液的緩沖即可。

4.2 膜蛋白的鑒定

SDS-PAGE跑膠鑒定膜蛋白時，煮沸處理可能會導致膜蛋白的聚集?？梢栽谑覝胤跤?0min，再直接跑膠。膜蛋白通常不會遷移在SDS-PAGE上預測分子量的位置處。它們一般會遷移得快一些（也就是看起來較?。?，這可能是因為折疊得不完全或者每個分子量單位比水溶性蛋白結(jié)合了更多的SDS的原因 ^[5]。

5. 膜蛋白的表達

剛剛介紹了關(guān)于去垢劑的基本性質(zhì)，但實際上制備膜蛋白是非常困難的。大部分的膜蛋白不能從天然環(huán)境中足量獲得，需要嘗試過度表達。不幸的是，通過大腸或其他系統(tǒng)，很難獲得足量的有功能性且穩(wěn)定的膜蛋白。通常，跨膜次數(shù)越高的膜蛋白越難表達，例如包含6次跨膜域的水通道蛋白。

5.1 水通道蛋白

水通道蛋白，是一種位于細胞膜上的6次跨膜蛋白質(zhì)，在細胞膜上組成“孔道”，可控制水在細胞的進出。水分子經(jīng)過水通道蛋白時會形成單一縱列，進入彎曲狹窄的通道內(nèi)，內(nèi)部的偶極力與極性會幫助水分子旋轉(zhuǎn)，以適當角度穿越狹窄的通道。

水通道蛋白主要大量存在于哺乳動物的腎臟，也存在于植物中。水通道在腎臟尿濃縮、消化生理、神經(jīng)生理、呼吸生理、眼球生理和皮膚生理等中都有作用。

5.2 水通道活性蛋白

CUSABIO采用大腸無細胞蛋白表達技術(shù)。該技術(shù)不受細胞結(jié)構(gòu)的限制，適于表達對細胞有毒害作用的膜蛋白和毒性蛋白，產(chǎn)量高達mg/ml。按照基于細胞的傳統(tǒng)表達方式，常規(guī)處理膜蛋白需要破壞細胞膜，這往往會引起插入其內(nèi)的膜蛋白的構(gòu)象變化甚至變性。而大腸無細胞開放的無細胞體系，可以體外多途徑優(yōu)化表達產(chǎn)量，并且在表達中，表達的膜蛋白可以在翻譯后立馬被去垢劑包裹，最大限度的避免暴露在水溶液中?，F(xiàn)已開發(fā)以下活性水通道蛋白。

Recombinant Escherichia coli Aquaporin Z (aqpZ)

Function: Channel that permits osmotically driven movement of water in both directions. It is involved in the osmoregulation and in the maintenance of cell turgor during volume expansion in rapidly growing cells. It mediates rapid entry or exit of water in response to abrupt changes in osmolarity.

aqpZ in detergent micelles

(Tris-Glycine gel) Discontinuous SDS-PAGE (reduced) with 5% enrichment gel and 15% separation gel.

The binding activity of aqpZ with ytfE.

Activity: Measured by its binding ability in a functional ELISA. Immobilized aqpZ at 5 μg/ml can bind E.coli ytfE, the EC₅₀ of E.coli ytfE protein is 197.90-259.70 μg/ml.