ELISA檢測影響因素淺析

一、樣品方面

ELISA作為一項成熟的檢測技術(shù)，適用于多種樣本的檢測。其中血清、血漿、尿液、唾液等樣本較為常見，規(guī)范的取樣操作、合適的存放條件都是保證檢測結(jié)果準確的必要條件。

實際上，樣本采集、存放過程中很多因素可能引起檢測結(jié)果的差異，如溶血樣本由于紅細胞裂解釋放出具有過氧化酶活性的物質(zhì)，進而發(fā)生非特異性顯色反應(yīng)，產(chǎn)生假陽性 ^[2]；部分資料顯示，對于溶血樣本，可以測定血清Hb濃度判斷溶血程度。非溶血標本血清游離Hb為4.8±3.2mg/dL，中度溶血血清Hb為43.5±13.9mg/dL。超過此范圍的樣本最好做復(fù)檢，避免假陽性結(jié)果。依據(jù)檢測指標，選擇合適的樣本，而對于較為敏感指標（如LDH、ACP等），即使輕微溶血也可能導(dǎo)致測定結(jié)果偏高，此類樣本應(yīng)盡量避免使用。對于溶血判斷，較為簡易便捷的方法則是肉眼觀察，當血清清亮，呈櫻紅色，為中度溶血，此時需重新采集。為更好避免溶血情況發(fā)生，建議SST管或抗凝管采樣。高脂血同樣也是比較常見的，嚴重的也稱為牛奶血，呈乳白色或混濁狀，其通過不均一性、脂質(zhì)顆粒粘附在管壁等影響檢測結(jié)果。理論采用高速離心可除去，但可能對檢測結(jié)果有影響。

另外，樣本污染或存放不當都會對檢測結(jié)果造成影響，如樣本受到細菌污染，則會產(chǎn)生非特異性顯色而干擾結(jié)果；塑料管能吸附抗原使樣本內(nèi)抗原含量下降，容易假陰性，最好使用真空采血管。

二、操作方面

ELISA是一項可重復(fù)性很高的檢測技術(shù)，操作簡便易行，但操作中的各個環(huán)節(jié)對實驗的檢測效果影響較大，正確嚴格的操作是保證實驗成果的關(guān)鍵。

對于加樣：ELISA是基于微孔板的反應(yīng)，所需樣本量較小，若樣本粘附于孔壁或加樣量不足，微孔板內(nèi)樣本量不足以參與與抗原或抗體的反應(yīng)，則會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此充足的樣本量是首要條件，考慮使用準確性高的移液器且定期進行校正，加樣時宜垂直懸空加入微孔底部，需注意避免碰到管底或管壁，防止濺出或產(chǎn)生氣泡，同時更換槍頭，做到“一樣一吸頭”，避免交叉污染。

對于溫育：ELISA是基于抗原抗體特異性結(jié)合的反應(yīng)，抗原抗體反應(yīng)需要合適的溫度。對于大多數(shù)抗原抗體，37℃是最佳反應(yīng)溫度，結(jié)合效率最高。ELISA操作中需將酶標板置于合適的溫度溫育，由于酶標板結(jié)構(gòu)特別，較易產(chǎn)生邊緣效應(yīng)，同時基于很多恒溫箱構(gòu)造，溫度顯示并非酶標板溫育溫度，導(dǎo)致個別樣本檢測結(jié)果異常?？蛇x用水浴法溫育，避免受熱不均產(chǎn)生邊緣效應(yīng)，同時貼上密封膜防止污染或液體蒸發(fā) ^[3]，切勿縮短溫育時間。

對于洗板：其目的在于除去非特異性成分，使免疫復(fù)合物與待測抗體 (抗原) 呈一定比例，洗板是ELISA操作中重要的環(huán)節(jié)。有條件的實驗室，可采用機洗，可在一定程度避免污染，提高效率，需注意觀察洗液針、沖洗頭是否通暢 ^[4]，這是考慮到血清中殘留纖維蛋白絲或洗滌液有析出的結(jié)晶存在時，易使洗板機針孔阻塞；調(diào)整注水量，設(shè)置好洗板時間及次數(shù)、力度，避免力度過大造成酶結(jié)合物丟失，檢測結(jié)果偏低。對于不方便的實驗室，則可用手洗，可反復(fù)模擬操作，避免洗板不干凈造成“花板”，影響檢測結(jié)果。洗板結(jié)束后將板垂直扣于干凈的吸水紙或毛巾上，拍干。

對于顯色及判讀：ELISA多用HRP為催化酶，作用于TMB發(fā)生顯色。顯色是最后一步溫育反應(yīng)，研究表明，顯色溫度對實驗結(jié)果有明顯影響，溫度過低導(dǎo)致結(jié)合反應(yīng)速率變慢，顯色不充分，容易漏檢低值結(jié)果。而顯色時間不宜過短，鑒于一些低滴度可能不能及時出現(xiàn)反應(yīng)，造成假陰性結(jié)果。嚴格控制顯色反應(yīng)的溫度和時間至關(guān)重要。ELISA測定需要通過酶標儀測定，研究資料建議首選雙波長，可以減少測定干擾和電路干擾 ^[1]，提高臨界值處的樣本的分析正確度，減少對弱陽性樣本的漏檢，從而減少實驗誤差。

三、試劑方面

市場ELISA產(chǎn)品眾多，眼花繚亂，參差不齊，高質(zhì)量的產(chǎn)品仍然是重中之重 ^[5]，也是保證實驗結(jié)果可靠的先決條件。選擇知名度相對高的試劑。切忌不要混用，更不要使用過期試劑。實驗操作前，通常需將試劑從冰箱拿出，平衡30-60min，使微孔內(nèi)溫度較快達到所需溫度，而忽略這一操作可能導(dǎo)致一些弱陽性的樣本出現(xiàn)假陰性。

綜上所述，影響ELISA結(jié)果的因素有很多，無論是樣品、操作還是試劑都可能影響到最終的實驗結(jié)果。因此，在進行ELISA檢測時，要采取相應(yīng)措施排除干擾因素，同時嚴格執(zhí)行SOP標準化規(guī)程，認真做好ELISA全程質(zhì)量控制，保證ELISA檢測結(jié)果的準確度 ^[6]。