ALPi——腸粘膜屏障保鏢

1、什么是ALPi？

腸堿性磷酸酶（Intestinal alkaline phosphatase, ALPi） 位于腸粘膜的刷狀邊緣，能夠水解單磷酸脂，是一種由腸上皮細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源性蛋白質(zhì)，不僅在粘膜 和腸腔內(nèi)保持活性，而且分泌到血清后也能保持活性，對維持腸道內(nèi)環(huán)境平衡起到重要作用。由荷蘭生物制藥 公司AM-Pharma贊助的Peters和Lukas進(jìn)行的臨床研究已證實當(dāng)人和動物從腸道吸收內(nèi)毒素時，ALPi對內(nèi)毒素進(jìn) 行充分滅活，使其失去大部分活性。因此ALPi可以用于針對內(nèi)毒素相關(guān)敗血癥腎損傷和結(jié)腸炎中炎癥的新方法 ^[2,3]。

2、ALPi與腸黏膜屏障作用機(jī)制

研究顯示，各種緊密連接蛋白的低表達(dá)可損害腸粘膜屏障功能，進(jìn)而影響腸 粘膜通透性。腸道細(xì)菌、內(nèi)毒素、炎性介質(zhì)等會通過受損的腸粘膜屏障進(jìn)入內(nèi)環(huán)境，導(dǎo)致更多炎性介質(zhì)的釋放 ，激活全身炎癥反應(yīng)綜合征的進(jìn)程，循環(huán)損害腸粘膜屏障功能，最終導(dǎo)致多臟器功能衰竭的發(fā)生。而ALPi可以 誘導(dǎo)閉鎖小帶蛋白1(Zonulaoccludens-1, ZO-1)、閉鎖小帶蛋白2(Zonulaoccludens-2, ZO-2)、閉鎖蛋白（Occludin），水 閘蛋白（Claudin）表達(dá)水平的升高，增強(qiáng)腸粘膜屏障功能。

2.1 ALPi維護(hù)腸黏膜機(jī)械屏障

腸道機(jī)械屏障作為腸黏膜屏障重要的一部分，其腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白 發(fā)揮著重要的作用，而ALPi在維持細(xì)胞間緊密連接發(fā)揮作用。

Rentea等研究發(fā)現(xiàn)，壞死性小腸結(jié)腸炎大鼠幼崽腸道對大分子物質(zhì)的通透 性增加約15倍，給予低劑量外源性牛ALPi后，其腸道通透性得到明顯改善 ^[4]。Hamarneh等首先通 過研究ALPi基因敲除小鼠和野生型小鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因敲除小鼠緊密連接蛋白表達(dá)量較野生型小鼠低,證實腸道 屏障受損與ALPi表達(dá)缺失相關(guān) ^[5]。說明ALPi在腸黏膜機(jī)械屏障維護(hù)發(fā)揮著重要作用。但是目前的 數(shù)據(jù)僅依據(jù)于實驗結(jié)果，對ALPi,和黏膜屏障以及蛋白間的信號通路影響機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。

2.2 ALPi支持腸黏膜免疫屏障

腸道免疫屏障由獲得免疫和固有免疫兩部分構(gòu)成, 免疫球蛋白A (immuno globulinA, IgA)和抗菌肽及黏蛋白分別構(gòu)成獲得免疫和固有免疫的重要效應(yīng)分子和活性成分。人體腸道中存在 大量的革蘭陰性細(xì)菌, 脂多糖(lipo poly saccharide, LPS)作為革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁重要組成部分，是引發(fā)腸 道炎癥反應(yīng)的重要因素。Bates等和Bentala等的研究發(fā)現(xiàn)ALPi可通過激活腸上皮細(xì)胞Toll樣受體(Toll-likereceptors, TLR4)基因表達(dá)，識別革蘭氏 陰性細(xì)菌外膜中的LPS并誘導(dǎo)宿主進(jìn)行免疫應(yīng)答和損傷修復(fù)，巨噬細(xì)胞募集(級聯(lián)誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞)激活誘導(dǎo)核 因子-κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)和TLR3基因, 并通過MyD88依賴途徑抑制炎癥性細(xì)胞因 子白細(xì)胞介素(interleukin, IL-1)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、IL-6和IL-12 的表達(dá), 從而抵抗腸道感染。TLR4的大量激活可能進(jìn)一步抑制了TNF-α的表達(dá), 抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng) ，從而降低LPS的毒性 ^[6，7]。Hwang等研究發(fā)現(xiàn)也表明，ALPi通過TLR4/NF-κB介導(dǎo)途徑維 護(hù)腸黏膜屏障功能的正常 ^[8]。上述研究結(jié)果表明，ALPi可通過催化LPS去磷酸化，間接地介導(dǎo)腸 道炎性反應(yīng)的下調(diào)，從而參與腸黏膜免疫屏障功能的維護(hù)和調(diào)節(jié)(如圖1)。

2.3 ALPi調(diào)節(jié)腸黏膜化學(xué)屏障

作為腸黏膜屏障中重要的一部分，化學(xué)屏障受損也會增加腸道炎癥的易感性 。ALPi主要在十二指腸中表達(dá)，可以調(diào)節(jié)腸道內(nèi)碳酸鹽的分泌情況，借此改變十二指腸表面的PH值，使影響體 內(nèi)炎癥的微生物組環(huán)境得到改善。Mizumori等研究發(fā)現(xiàn), 當(dāng)黏膜表面pH值>8，ALPi表達(dá)量及酶的活性最高， 當(dāng)黏膜表面pH較低時, ALPi所具有的ATP酶活性降低。提示ALPi作為腸道pH調(diào)節(jié)的堿性傳感器，在調(diào)節(jié)腸黏膜化 學(xué)屏障、在改善腸內(nèi)酸堿環(huán)境維持腸道穩(wěn)態(tài), 維持腸黏膜屏障功能的關(guān)鍵作用。

2.4 ALPi增強(qiáng)腸黏膜生物屏障

腸粘膜生物屏障的完整對維持腸道內(nèi)生物菌落有著重要的意義，已有研究表 明豬腸道細(xì)菌定植前后，腸道ALPi表達(dá)水平并無明顯變化，而在小鼠和大鼠腸道細(xì)菌定植后，ALPi的表達(dá)水平 降低 ^[9]。

而給小鼠口服大腸桿菌，構(gòu)建腹膜炎生物模型，然后用ALPi干預(yù)后檢測細(xì)菌 移植的情況，結(jié)果證明ALPi可以抑制小鼠的腹膜炎惡化和細(xì)菌移植情況。, 檢測細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 (ERK) 磷 酸化水平和ERK-特異性蛋白-1 (SP-1) -血管內(nèi)皮生長因子 ( VEGF) 和ERK-尾型同源異型核基因2 (Cdx-2) -緊 密連接蛋白2(Claudin-2)等信號通路蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)ALPi抑制Claudin-2和VEGF表達(dá)，降低黏膜通透性抑 制菌群位移來增強(qiáng)腸粘膜生物屏障。

3、ALPi對MLCK/pMLC信號通路的影響

MLCK/pMLC信號通路是炎癥相關(guān)的信號通路，可以被腫瘤壞死因子-α（ TNF-α）激活，導(dǎo)致緊密連接結(jié)構(gòu)和組成的分子重組，引起閉鎖蛋白（Occludin）內(nèi)吞。為了研究ALPi對 TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞的屏障功能損害的抑制作用機(jī)制，劉翀等人研究了ALPi對炎癥相關(guān)MLCK/pMLC信 號通路的影響。Caco-2細(xì)胞中的MLCK和pMLC蛋白的表達(dá)，在TNF-α作用下明顯升高（p<0.01）。而加 入ALPi后，與TNF-α組比較，IAP+TNF-α組顯著抑制了MLCK（p<0.01）和pMLC（p<0.05）蛋 白的表達(dá)水平（圖2）。以上結(jié)果表明，ALPi抑制了TNF-α誘導(dǎo)的MLCK/pMLC信號通路的激活，抑制了炎癥 反應(yīng)的發(fā)生。

此外，由于L-PHE是ALPi特異性的抑制劑，經(jīng)實驗證明ALPi能夠通MLCK/pMLC信號通路，調(diào)節(jié)緊密連接蛋 白ZO-1、Occludin和Claudin-1緊密連接蛋的表達(dá)，從而降低TNF-α對Caco-2細(xì)胞屏障功能的損害。

4、ALPi與疾病的關(guān)系

4.1 腸堿性磷酸酶與腸粘膜屏障相關(guān)疾病

炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease，IBD）是累及腸道的一類特發(fā)性 腸道炎癥性疾病。腸源性細(xì)菌抗原引起的黏膜免疫應(yīng)答參與炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)制，Toll樣受體配體--尤其是 脂多糖(LPS)對該病的維持起著重要作用，已有研究表明腸堿性磷酸酶能夠解毒LPS。對IBD小鼠經(jīng)口喂食外源性 的ALPi，可以在腸上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬，降低腸粘膜通透性，從而起到明顯的治療作用 ^[10] 。

4.2 腸堿性磷酸酶與壞死性小腸結(jié)腸炎

目前，ALPi在治療炎癥性腸病等方面應(yīng)用前景十分廣闊。從牛小腸提取的堿 性磷酸酶（Bovines Intestinal Alkaline Phopaatase，bALPi）是最常用的商品化ALPi。壞死性小腸結(jié)腸炎（ Necrotizingenterocolitis，NEC）病因復(fù)雜，Rentea等人研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充ALPi可以降低NEC損傷的嚴(yán)重程度 ^[11]。

4.3 腸堿性磷酸酶與急性腎損傷

動物實驗表明，腎器官缺血損傷后，腎臟中的磷酸酶活性降低 ^[12] 。因ALPi對LPS有抑制作用，可以改善急性腎損傷（AKI）。對膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷（AKI）患者或敗 血病患者在AKI發(fā)病后48小時內(nèi)靜脈輸注堿性磷酸酶，能顯著改善腎功能，如血漿肌酐值下降和肌酐清除率升高 ，相關(guān)的接受ALPi治療的患者可以減少透析的持續(xù)時間.

4.4 腸堿性磷酸酶與代謝類疾病

Madhu等人發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，ALPi基因敲除小鼠腸道內(nèi)需氧菌和厭氧 菌的數(shù)量有所減少。當(dāng)基因敲除小鼠口服ALPi后，其腸道菌群基本正?；?^[13]。KaliannanK等人 通過實驗研究得到ALPi還與代謝性疾病有關(guān)的結(jié)論 ^[14]。Bhan等通過敲除小鼠ALPi基因，發(fā)現(xiàn)缺 乏ALPi的動物會患上2型糖尿病和高脂血癥 ^[15]，提示ALPi可能與糖尿病、高血脂等代謝性疾病相 關(guān)。美國弗吉尼亞聯(lián)邦大學(xué)的研究人員研究發(fā)現(xiàn)IAP的過表達(dá)可以通過維持腸道黏蛋白層的完整性來改善腸屏障 功能，進(jìn)而限制腸源性LPS的易位，并減弱腸道對脂質(zhì)的吸收，由此減弱高脂肪和高膽固醇食物引起的動脈粥樣 硬化的發(fā)展。證明ALPi的表達(dá)增加可以對腸道屏障功能和代謝性疾病的發(fā)展起到直接的保護(hù)作用