靶向蛋白降解技術“PROTAC”：“革命性”的靶向策略，重定義小分子藥物！

1、PROTAC背景介紹

蛋白降解靶向嵌合體（Proteolysis targeting chimeras，PROTAC）是一種新型靶向蛋白降解技術。2001年，Craig Crews和Raymond Deshaies教授提出PROTAC概念，并報道了首個PROTAC分子—PROTAC-1，可靶向降解甲硫氨酰氨肽酶-2（METAP2），開創(chuàng)了這一革命性的技術 ^[1]。2008年，Crews團隊采用Nutlin招募MDM2來啟動降解級聯(lián)，用于靶向雄激素受體（AR，Androgen receptor）。這一小分子能夠將雄激素受體AR招募到MDM2附近，使其泛素化，并隨之被蛋白酶體復合體降解 ^[2]。這一能夠靶向蛋白進行降解的嵌合分子，被命名為PROTAC（Proteolysis Targeting Chimera）（圖1） ^[3]。

隨著PROTAC技術的不斷發(fā)展及完善，PROTAC如今已獲得眾多腫瘤藥物研發(fā)者的關注。傳統(tǒng)的癌癥藥物靶點絕大部分是具有適合的結合位點和明確的活性位點的蛋白質。而PROTAC技術在降解癌細胞過程中，將靶蛋白誘導到蛋白降解系統(tǒng)即可使癌細胞失活，不一定要和靶蛋白的活性位點結合才能發(fā)揮作用，這使得其在理論上可以對絕大部分蛋白發(fā)生作用。與此同時，它還能克服傳統(tǒng)小分子的耐藥性問題。如今，越來越多的公司開始參與PROTAC研發(fā)，PROTAC技術已從學術界轉移到制藥界，其豐富的未來管線，儼然成為目前新藥研發(fā)領域最火熱的技術之一，受到科研院所、藥企和投資機構的青睞。

圖1. PROTAC新型靶向蛋白降解技術 ^[3]

2、PROTAC技術原理

2.1 “泛素-蛋白酶體系統(tǒng)”（UPS）

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（Ubiquitin Proteasome System，UPS），即泛素介導的蛋白降解系統(tǒng)，它是PROTAC降解蛋白所采取的途徑 ^[4]。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)UPS是細胞調節(jié)蛋白質水平的主要途徑，參與細胞內80%以上蛋白質的降解，用于降解細胞內受損或不再需要的蛋白質，降解的異常往往會導致腫瘤等疾病的發(fā)生 ^{[5, 6]}。就也是說，泛素分子在一系列酶作用下，將細胞內的蛋白質分類，從中選出靶蛋白分子，對靶蛋白進行特異性修飾，形成靶蛋白多聚泛素鏈，該泛素鏈指導底物在蛋白酶體處降解。目前，這些酶主要包括E1活化酶、E2結合酶、E3泛素連接酶。

具體而言，“泛素-蛋白酶體系統(tǒng)”降解蛋白的途徑包括四個階段 （圖2）：①泛素活化，泛素甘氨酸端的羧基連接到泛素活化酶E1的巰基，ATP被E1泛素激活酶消耗，產(chǎn)生活化的泛素-腺苷酸；②泛素激活酶E1，將活化后的泛素通過交酯化過程交給泛素結合酶E2；③泛素連接酶E3，為泛素-蛋白酶體系統(tǒng)選擇性降解機制的關鍵因素，識別被降解的蛋白。它將結合E2的泛素連接到靶蛋白質上并釋放E2，形成特定的泛素化的蛋白質；④泛素化的蛋白質被蛋白酶體識別并結合，最終在蛋白酶的催化下蛋白質分解為短肽或氨基酸 ^[7]。

圖2. “泛素-蛋白酶體系統(tǒng)”降解蛋白的途徑 ^[7]

2.2 PROTAC分子結構特點

現(xiàn)有的PROTAC由3部分組成：一端為靶蛋白結合配體，另一端為E3泛素連接酶配體，中間則為連接鏈（linker）（圖3） ^[7]。PROTAC是一種雙功能分子，可以同時與靶蛋白及E3結合，使本來不能與E3結合的靶蛋白泛素化進而被蛋白酶體識別并降解。與傳統(tǒng)的針對蛋白激酶活性位點的小分子不同，PROTAC的靶蛋白可以是沒有明顯活性位點的蛋白質，這能夠顯著增加靶蛋白的數(shù)量，也使研究者能利用現(xiàn)有的E3連接酶處理新發(fā)現(xiàn)的靶蛋白，增加PROTAC在設計上的選擇。此外，PROTAC分子本身的靈活性更使得其應用前景十分廣泛。

圖2. PROTAC分子結構 ^[7]

2.3 “靶蛋白-PROTAC-E3泛素連接酶”三元復合體

在PROTAC誘導靶蛋白降解的過程中，“靶蛋白-PROTAC-E3泛素連接酶”三元復合物的形成作為其核心，是PROTAC對靶蛋白進行多泛素化修飾中必經(jīng)的步驟。PROTAC只有與靶蛋白和E3連接酶同時結合，形成三元復合物時才能起作用（圖4） ^[8]。

目前，已鑒定出600多種人類基因組編碼的E3連接酶，多個應用于PROTAC分子設計的E3泛素連接酶被發(fā)現(xiàn)，包括CRBN、VHL、凋亡蛋白抑制蛋白（IAPs）、MDM2和DCAF16等等。但臨床的PROTAC管線披露的E3降解酶大多數(shù)是CRBN。另有研究提示，骨骼肌中表達的KLHL41，神經(jīng)系統(tǒng)中表達的RNF182、TRIM9，以及腫瘤中表達的CDC20、CIAO1、WD82或可用于后續(xù)的PROTAC分子設計，這將進一步豐富PROTAC的性能 ^[9-10]。

靶蛋白包括核受體（ER、AR、RAR）、蛋白激酶（AKT、RIPK2、CDK9、BTK、TBK1、BCR-ABL、CDK2/4/6/9、ALK、CK2、PI3K、ERK1/2）、蛋白質轉錄調控蛋白（BRD4、Sirt2、TRIM24、HDAC6）、調節(jié)蛋白（ERRα、FKBP12、TACC3）、神經(jīng)退行性相關蛋白（Huntingtin、Tau、α-synuclein）、胞外代謝酶（MetAP-2、DHODH）、表觀遺傳相關蛋白（PCAF/GCN5）等30余種蛋白及其突變體 ^{[9-12, 26]}。

圖4. “靶蛋白-PROTAC-E3泛素連接酶”三元復合體形成途徑 ^[8]

3、PROTAC在腫瘤治療中的應用

蛋白降解靶向嵌合體PROTAC通過利用泛素蛋白酶體途徑實現(xiàn)對靶蛋白降解，顛覆了傳統(tǒng)小分子抑制劑的理念。PROTAC能在微小劑量時發(fā)揮高效的作用，降低耐藥性；PROTAC能夠循環(huán)作用，且能作用“不可成藥”蛋白，具有高效的靶向性，這是以往的抗腫瘤藥物少有的優(yōu)點。目前，PROTAC技術在臨床研究中已經(jīng)成功實現(xiàn)了針對前列腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌等疾病相關靶點（如AR、ER、EGFR、KRAS、ABL）的成功降解 ^[13-27]。

3.1 PROTAC在前列腺癌中的應用

前列腺癌是一種在男性中很常見的癌癥，該病的診斷與雄激素受體（AR）有著密切關系。AR拮抗劑，如苯扎魯胺（Enzalutamide）已用于前列腺癌患者的治療，療效顯著，但常出現(xiàn)耐藥性。針對AR的PROTAC已多次被證明優(yōu)于苯扎魯胺，特別是在雄激素水平升高，以及AR突變將拮抗劑轉化為激動劑的耐藥環(huán)境中 ^[13]。目前，多款AR的PROTAC針對耐藥的去勢前列腺癌，處于臨床試驗階段。

3.2 PROTAC在乳腺癌中的應用

在乳腺癌患者中，約70%表現(xiàn)為雌激素受體（ER，Estrogen receptor）陽性乳腺癌，因此ER是乳腺癌藥物研究中一個重要靶點。但是大部分的初發(fā)乳腺癌會在用藥之后獲得對雌激素抗體類藥物（如氟維司群）的耐藥性。相比之下，采用ER的PROTAC能誘導有效的降解，并且可以改善其藥理特性 ^[14]。

除了ER外，還有一些與乳腺癌相關的靶點，如CDK4/6、HER2、PARP1、TACC3、BET家族蛋白（BRD2、BRD3、BRD4和BRDT）等等，研究人員利用PROTAC技術設計合成了相應的PROTAC分子，它們在細胞水平對靶蛋白均有降解作用，部分化合物在動物體內也有較好的活性 ^[15-17]。這些研究表明，PROTAC靶向蛋白降解有望為治療乳腺癌提供新的策略。

3.3 PROTAC在非小細胞肺癌中的應用

EGFR作為一種受體酪氨酸激酶（RTK），與細胞凋亡、增殖、代謝和存活的調控密切相關。盡管EGFR靶向肺癌小分子藥物已廣泛應用于醫(yī)學領域，但是許多患者用藥后出現(xiàn)獲得性耐藥，影響了后續(xù)的治療效果。目前，國內外許多研究團隊也正在利用PROTAC技術開展靶向降解EGFR的研究 ^[18]。值得關注的是，國內已有3家進入臨床研究階段，來自上?？萍即髮W（SIAIS164018）、同濟醫(yī)科大學（DP-C-4）、中國藥科大學（PROTAC EGFR degrader 2）。

KRAS作為治療NSCLC的新靶點，在細胞的生存和周期進程等方面發(fā)揮重要作用，是NSCLC中最常發(fā)生突變的基因之一。KRAS一度被認為是“不可成藥”靶點，2020年，Crews團隊報道了首個可降解KRAS G12C的PROTAC分子，是PROTAC技術靶向不可成藥蛋白領域一項重要突破。此外，約4%的NSCLC伴有ALK融合基因，當前有研究團隊正在利用PROTAC技術開發(fā)靶向ALK的降解劑，有望為ALK耐藥突變的患者尋找一份新的屏障 ^{[19, 20]}。

3.4 PROTAC在依賴性慢性粒細胞白血病中的應用

BCR-ABL激酶抑制劑的出現(xiàn)，改變了慢性粒細胞白血?。–ML）患者的生活，但是，在大多數(shù)患者中激酶抑制并不能徹底根治。已有報道，開發(fā)誘導BCR-ABL降解的PROTAC，表現(xiàn)出明顯的選擇性并顯著抑制BCR-ABL+白血病細胞的生長，從而抑制BCR-ABL介導的信號通路 ^[21]。目前，更多基于PROTAC的新型CML抗癌劑已處于臨床階段。

3.5 PROTAC在其它疾病中的應用

除了靶向降解腫瘤疾病的關鍵蛋白，另一種具有挑戰(zhàn)性的目標蛋白是易于聚集的蛋白。α-突觸核蛋白（SNCA）和tau蛋白與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制和相關功能障礙密切相關，通過PROTAC直接募集到E3連接酶來降解這些蛋白質，是治療該類疾病以及蛋白質聚集性疾病的一種可行方法。事實上，PROTAC的幾項研究已經(jīng)開始通過誘導tau降解來治療阿莫斯海默癥 ^[22-24]。

4、PROTAC分子的藥物前景

PROTAC技術作為一種新興的蛋白降解技術，具有靶向不可成藥靶點、克服耐藥性等小分子抑制劑不可比擬的潛在優(yōu)勢，正處于快速發(fā)展時期。隨著研究人員對UPS體系、PROTAC和蛋白質靶標配體的了解，以及更多E3連接酶配體的發(fā)現(xiàn)，這將進一步加速PROTAC的成功開發(fā)。PROTAC技術現(xiàn)已知可以降解80多個靶點的100多種蛋白，在治療腫瘤、病毒感染以及神經(jīng)退行性疾病等領域均有深入的研究。越來越多的國際大藥企紛紛布局PROTACs臨床研究，包括羅氏（Roche）、渤健（Biogen）、葛蘭素史克（GSK）、賽諾菲（Sanofi）等等。相信不久就會有靶向降解腫瘤靶點蛋白的PROTAC分子藥物獲批，為腫瘤等多種疾病提供一種革命性的新治療手段（表1）。

來自PharmSnap部分數(shù)據(jù)

5、PROTAC研究涉及的熱門靶向蛋白和E3泛素連接酶

基于PROTAC技術的藥物研究，在過去幾年中呈指數(shù)級增長并日益成熟。利用PROTAC降解靶蛋白治療惡性腫瘤等疾病的前景無疑是樂觀的。華美生物匯總PROTAC研究涉及的E3泛素連接酶和熱門靶點蛋白，涵蓋：腫瘤特異性靶點，生長抑制因子，細胞死亡，血管生成，細胞的增殖、侵襲和轉移等靶點，助力您針對特定靶點的PROTAC分子方面的研究或其潛在臨床價值的探索！

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