CLDN6：繼CLDN 18.2之后，下一個(gè)癌癥治療的“新寵”！

1、Claudins家族的發(fā)現(xiàn)

Claudins（CLDNs）蛋白家族最早在1998年由Furuse Mikio等人從雞肝中克隆得到并為之命名，是緊密連接（Tight junctions，TJs）的重要組成部分 ^[1-2]。緊密連接主要由occludin，CLDNs，緊密連接黏附分子構(gòu)成。在哺乳動(dòng)物中，迄今為止發(fā)現(xiàn)了27個(gè)Claudins成員，隨著研究的深入，Claudins家族成員還將不斷壯大 ^[3-4]。大量研究已證實(shí)，Claudins家族是TJs必不可少的骨架蛋白，在維持上皮和內(nèi)皮細(xì)胞中的細(xì)胞極性、細(xì)胞間的粘附固定、細(xì)胞旁路的離子運(yùn)輸?shù)确矫姘l(fā)揮重要作用 ^[5-8]。

Claudins成員，廣泛分布于不同的組織器官中，其表達(dá)具有多樣化的特性。近年來(lái)的大量研究數(shù)據(jù)揭示，Claudins的異常表達(dá)與多種腫瘤相關(guān)，涌現(xiàn)出更多的Claudins家族潛力靶點(diǎn)，用于腫瘤臨床診斷和治療（圖1） ^[9]。不僅在癌癥中扮演重要角色，也同其它疾病息息相關(guān)。例如，CLDN1的異常表達(dá)可導(dǎo)致硬化性膽管炎和魚鱗病 ^[10-11]；CLDN3的增加與肺泡屏障功能降低有關(guān) ^[12]。在癌癥免疫治療領(lǐng)域，Claudins家族成員CLDN18的異構(gòu)體CLDN18.2，已成為藥企必爭(zhēng)靶點(diǎn)的高地（點(diǎn)擊查看CLDN18.2相關(guān)文章）。如今，CLDN6作為Claudins家族“新寵”，腫瘤靶向藥物的研發(fā)也是勢(shì)如破竹，令人期待！

圖1. Claudins靶向藥物的臨床應(yīng)用 ^[9]

2、什么是CLDN6？

CLDN6作為27個(gè)CLDN家族成員之一，是組成細(xì)胞間緊密連接的重要分子。CLDN6位于染色體16p3.3，分子量大約20-40kDa。Claudins成員之間具有相似的結(jié)構(gòu)，每個(gè)Claudin分子有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，2個(gè)細(xì)胞外環(huán)和2條胞內(nèi)尾區(qū)。CLDN6擁有一個(gè)C端的PDZ結(jié)合位點(diǎn)，使得緊密連接蛋白能與細(xì)胞內(nèi)某些蛋白發(fā)生相互作用關(guān)系，在細(xì)胞連接及上皮組織通透性等方面均可發(fā)揮重要作用（圖2） ^[13]。對(duì)CLDN6蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的研究是進(jìn)一步了解CLDN6分子特性和功能的前提和基礎(chǔ)，目前關(guān)于CLDN6的高級(jí)結(jié)構(gòu)的研究尚處于初級(jí)階段。然而值得關(guān)注的是，越來(lái)越多的研究表明，CLDN6異常表達(dá)可參與乳腺癌 ^[14]，卵巢癌 ^[15]，宮頸癌 ^[16]，胃癌 ^[17]，肺癌 ^[18]等多種惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展過(guò)程。

由于腫瘤細(xì)胞易于侵襲轉(zhuǎn)移，細(xì)胞之間結(jié)構(gòu)較正常細(xì)胞排列錯(cuò)亂，導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)因子或者藥物在流動(dòng)過(guò)程中阻力增加，難以突破細(xì)胞間的屏障到達(dá)腫瘤細(xì)胞內(nèi)，抗腫瘤藥物無(wú)法髙效發(fā)揮作用。因此，探索打開(kāi)細(xì)胞緊密連接，為抗腫瘤藥物以及正常信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)清除障礙，成為腫瘤治療中的新思路。CLDN6作為細(xì)胞骨架的形成和細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)節(jié)的重要分子，可影響細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)程，這為腫瘤的診斷和干預(yù)提供了新的方向。目前，多款針對(duì)CLDN6的藥物已處于臨床和臨床前階段，用于多種腫瘤的治療。

圖2. CLDNs家族結(jié)構(gòu)示意圖 ^[13]

3、CLDN6相關(guān)的信號(hào)通路

目前的研究普遍認(rèn)為，CLDN蛋白表達(dá)升高或降低，磷酸化及去磷酸化，都會(huì)導(dǎo)致一定程度的細(xì)胞極性缺失和細(xì)胞間分子異常擴(kuò)散等變化，而此種變化的主要原因則是由于緊密連接正常結(jié)構(gòu)的破壞而引發(fā)的。另外，CLDN蛋白可能是通過(guò)高度特異性的胞內(nèi)信號(hào)通路所起作用的，但目前絕大多數(shù)CLDN蛋白在腫瘤中的作用機(jī)制尚不清楚。大量研究表明，CLDN6基因可能直接或間接參與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡等功能的調(diào)節(jié) ^[19]。

CLDN6可以通過(guò)不同的信號(hào)通路參與細(xì)胞調(diào)控，其復(fù)雜多樣的分子機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。比如，在宮頸癌細(xì)胞中，CLDN6的PDZ結(jié)合基序可以募集具有PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白AF-6，AF-6與Ras結(jié)合，抑制Ras和Raf的結(jié)合，使得Ras不能被Raf激活，從而抑制Ras的活性，進(jìn)一步抑制下游靶分子如ERK和PI3K等信號(hào)通路，以調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為 ^[13]。在乳腺癌中，過(guò)表達(dá)CLND6可以激活A(yù)SK1/P38通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 （圖3）；在肺腺癌中，CLDN6過(guò)表達(dá)細(xì)胞，可促進(jìn)P38 MAPK途徑的活化 ^[14] ；在結(jié)直腸癌中，CLDN6通過(guò)與ZO-1結(jié)合，調(diào)控PTEN/AKT信號(hào)通路，抑制腫瘤 ^[20]；在卵巢癌中，CLDN6通過(guò)ASK1參與細(xì)胞凋亡，進(jìn)而介導(dǎo)MAPK信號(hào)通路發(fā)揮作用 ^[15]。

圖3. CLDN6激活RIP1-ASK1-p38/JNK MAPK ^[19]

4、CLDN6在腫瘤等疾病中的作用

CLDN6等家族蛋白，在上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的形成過(guò)程中起了重要作用。CLDN家族通過(guò)細(xì)胞屏障、細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)保持了細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的平衡。CLDN6等家族蛋白的異常表達(dá)，可使得TJs功能受損，屏障功能降低，從而導(dǎo)致組織通透性提高，最終導(dǎo)致包括遺傳性、過(guò)敏性疾病，各個(gè)系統(tǒng)感染性疾病乃至腫瘤等多種疾病的發(fā)生。目前，關(guān)于CLDN6的研究，主要集中在腫瘤，尤其是卵巢癌，乳腺癌，宮頸癌。

4.1 CLDN6和腫瘤

在一項(xiàng)產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素（CPE）結(jié)合CLDN6調(diào)控卵巢癌的研究數(shù)據(jù)顯示，CLDN6在卵巢癌中高表達(dá)，CPE可加速卵巢癌細(xì)胞裂解；CLDN6編碼基因的敲除，可降低CPE高敏感株對(duì)CPE的敏感度，使得CPE無(wú)法破壞腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤增殖；而CLDN6過(guò)表達(dá)，可增加抗CPE細(xì)胞株對(duì)CPE的敏感度，促使腫瘤細(xì)胞裂解 ^[21]。在人乳腺癌細(xì)胞系中CLDN6低表達(dá)，當(dāng)過(guò)表達(dá)CLDN6時(shí)，MDA-MB-231細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性顯著降低，并顯示出侵襲性降低，緊密連接功能隨著菌落變得更緊密而增強(qiáng)；進(jìn)一步數(shù)據(jù)顯示，CLDN6的高表達(dá)，可導(dǎo)致Sp1和cyclin D1的表達(dá)下調(diào) ^[22-23]；另有研究表明，過(guò)表達(dá)CLDN6的宮頸癌細(xì)胞中，促凋亡蛋白Bax增多，抑凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl減少，這提示，CLDN6具有促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡的作用 ^{[13, 24]}。因此，CLDN6有望為卵巢癌等腫瘤靶向治療提供新方向。

4.2 CLDN6和多卵巢綜合征等疾病

有研究證實(shí)，CLDN6在多囊卵巢綜合征（Polycystic Ovary Syndrome，PCOS）和顆粒細(xì)胞（Granular Cells，GC）中呈高表達(dá)，減弱CLDN6表達(dá)，可抑制PCOS大鼠卵巢GC增殖并誘導(dǎo)GC凋亡 [25, 26]。PCOS以月經(jīng)稀發(fā)、高雄激素血癥、卵巢多囊樣改變?yōu)橹饕卣?，影響全?%~20%的育齡婦女。患有PCOS的女性中，GC異常增殖，并與卵巢內(nèi)雄激素的過(guò)量產(chǎn)生有關(guān)。另有研究報(bào)道，抑制CLDN6表達(dá)，可抑制子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。子宮內(nèi)膜異位癥是臨床常見(jiàn)婦科疾病且育齡女性的發(fā)病率較高，患者常有月經(jīng)量過(guò)多、痛經(jīng)等癥狀。以上研究意味著，CLDN6可能作為治療PCOS或子宮內(nèi)膜異位癥的潛在靶點(diǎn)。

5、CLDN6臨床研究進(jìn)展

來(lái)自ParmSnap數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，已有10多家企業(yè)布局CLDN6研發(fā)管線，集中在CLDN6抗體、ADC、雙特異性抗體、CART（參見(jiàn)下表）。具體來(lái)看，針對(duì)CLDN6藥物進(jìn)展較快的，來(lái)自日本安斯泰來(lái)制藥（Astellas Pharma Global Development, Inc.）旗下的IMAB-027抗體藥物，為靶向CLDN6的抑制劑，已處于臨床二期，適應(yīng)癥包括生殖細(xì)胞和胚胎腫瘤、睪丸腫瘤、卵巢癌，但尚未查到該項(xiàng)目的2期臨床數(shù)據(jù)。

安進(jìn)公司的AMG 794雙特異性抗體，靶向CD3 x CLDN6，處于臨床1期，適應(yīng)癥為卵巢上皮癌、非小細(xì)胞肺癌，以及非鱗狀非小細(xì)胞肺癌。在2022 AACR會(huì)議上，安進(jìn)公司披露AMG 794對(duì)表達(dá)CLDN6的非小細(xì)胞肺癌和上皮性卵巢癌細(xì)胞，具有可接受的臨床前安全性數(shù)據(jù)，支持AMG 794進(jìn)入臨床開(kāi)發(fā)。

德國(guó)拜恩泰科公司旗下有三款管線藥物在研BNT 211（臨床2期）、BNT-142（臨床1/2期）和CARVac Claudin6 mRNA vaccine（臨床1期）。在AACR會(huì)議上，德國(guó)拜恩泰科披露了BNT211 CAR-T+CARVac聯(lián)合治療CLDN6陽(yáng)性實(shí)體瘤的臨床初步數(shù)據(jù)，在16名接受治療患者中，CLDN6 CAR-T治療具有良好的耐受性，疾病控制率達(dá)到86%，客觀緩解率ORR為43%。

另外，4款雙特異性抗體藥物尚處于臨床前階段，分別來(lái)自Context Therapeutics LLC（CLDN6 x CD3），Novarock Biotherapeutics Ltd.（NBL-028；TNFRSF9 x CLDN6），天境生物（TJ-C64B；TNFRSF9 x CLDN6）、Integral Molecular, Inc.聯(lián)合Context Therapeutics LLC（IM-171，CLDN6 x CD3）。其中Novarock為石藥集團(tuán)的附屬公司，旗下的NBL-028的臨床前數(shù)據(jù)表明，NBL-028在小鼠模型中能夠有效抑制腫瘤并誘導(dǎo)免疫記憶的形成，且未檢測(cè)到肝損傷或全身毒性的跡象。

隨著越來(lái)越多的對(duì)緊密連接蛋白家族研究，CLDNs家族與腫瘤相關(guān)的分子機(jī)制和藥物研究正成為熱點(diǎn)和重點(diǎn)。繼CLDN18.2之后，CLDN6同樣作為緊密連接蛋白關(guān)鍵成員，CLDN6異常表達(dá)在卵巢癌等多種惡性腫瘤中扮演重要角色，尤其婦科腫瘤。利用CLDN6的空間結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)特點(diǎn)，尋找或設(shè)計(jì)針對(duì)CLDN6靶向藥物，去主動(dòng)調(diào)控CLDN6的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，干擾腫瘤的進(jìn)程，對(duì)于卵巢癌等腫瘤的早期診斷和精準(zhǔn)治療具有重要的價(jià)值！

表1. 靶點(diǎn)CLDN6的藥物研發(fā)最新進(jìn)展

為鼎力協(xié)助各藥企針對(duì)CLDN6靶點(diǎn)在卵巢癌等腫瘤藥物方面的研發(fā)工作，CUSABIO推出CLDN6四次跨膜蛋白活性產(chǎn)品（Code: CSB-MP005508HU(A4)），助力您在CLDN6機(jī)制方面的研究或其潛在臨床價(jià)值的探索。

● Recombinant Human Claudin-6(CLDN6)-VLPs (Active)

High Specifity Validated by Western Blot

The specifity was validated by western blot. CSB-MP005508HU(A4) is detected by Mouse anti-6*His monoclonal antibody.

Excellent Bioactivity Validated by Functional ELISA

Immobilized Human CLDN6 at 10 μg/ml can bind Anti-CLDN6/9 recombinant antibody (CSB-RA005508MA1HU), the EC₅₀ is 1.501-2.035 ng/mL

TEM

The presence of VLP-like structures was confirmed by TEM