TFPI：天然抗凝血因子，血友病療法的新選擇！

1、什么是TFPI？

組織因子途徑抑制物（Tissue Factor Pathway Inhibitor，TFPI）是一種體內(nèi)天然抗凝蛋白，它對(duì)組織因子途徑（即外源性凝血途徑）具有特異性抑制作用。結(jié)構(gòu)上，TFPI為單鏈糖蛋白，屬于Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，其結(jié)構(gòu)特征是存在三個(gè)串聯(lián)的Kunitz型抑制功能域，從N端到C端分別稱為K1，K2，K3。其中，Kunitz1能與FVIIa-TF復(fù)合物結(jié)合，Kunitz2能與FXa結(jié)合，但Kunitz3的意義尚未明確（圖1） ^[1]。一般而言，TFPI在體內(nèi)可大體分為三個(gè)池：①血管內(nèi)皮細(xì)胞的TFPI大部分結(jié)合于內(nèi)皮細(xì)胞表面，肝素可以刺激它的釋放；②血小板的TFPI在凝血酶的刺激下可釋放出來，與局部凝血過程的控制有關(guān)；③血漿中的TFPI大部分與脂蛋白結(jié)合 ^[2]。

生理情況下，TFPI主要錨著于血管內(nèi)皮細(xì)胞，TFPI的恒定表達(dá)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的抗凝血功能及維持血液的正常流動(dòng)非常重要。TFPI作為目前唯一能生理性抑制TF啟動(dòng)的外源性凝血途徑的一種內(nèi)源性抗凝蛋白，對(duì)TF誘導(dǎo)的凝血具有抑制調(diào)節(jié)作用，在白血病、心血管等疾病中發(fā)揮重要作用。那么TF是什么？TFPI又是如何發(fā)揮抗凝血作用？

圖1. TFPI三個(gè)串聯(lián)的Kunitz結(jié)構(gòu)

2、什么是TF？

組織因子（Tissue Factor，TF）是公認(rèn)的機(jī)體內(nèi)最強(qiáng)的促凝血因子之一，是生理止血的凝血過程和病理血栓形成的啟動(dòng)環(huán)節(jié)。成熟的TF分子主要由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成，其中，TF分子的胞外區(qū)是與凝血因子VII（FVII）或活化凝血因子（FVIIa）相結(jié)合并激發(fā)凝血的關(guān)鍵部位，具有促凝血活性 ^[3]。

在病理情況下，TF與血液中高親和力的凝血因子VII（FVII）結(jié)合，迅速轉(zhuǎn)為活化的凝血因子VIIa（FVIIa），形成FVIIa-TF活性復(fù)合物聚集在細(xì)胞表面，當(dāng)在磷脂和Ca²⁺存在時(shí)，F(xiàn)VIIa-TF又迅速激活酶原（FX），形成FXa。生成的FXa又能反過來激活FVII，可使更多FX激活，形成外源性凝血途徑的正反饋效應(yīng)。TF還能以較低的速度激活FIX，在局部生成大量凝血酶，出現(xiàn)血液凝固。因此，TF可同時(shí)激活內(nèi)、外源凝血途徑 （圖2）^{[4, 5]}。

圖2. TF激活內(nèi)外凝血途徑示意圖

3、TFPI抑制TF凝血作用機(jī)制

TFPI對(duì)TF凝血抑制作用屬于負(fù)反饋性質(zhì)。在病理情況下（如內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重受損、感染時(shí)均可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TFPI），TF表達(dá)并與血漿中的FVII或FVIIa結(jié)合激活外源性凝血途徑。

TFPI對(duì)TF凝血途徑的抑制主要分以下進(jìn)行：首先，TFPI通過K2與FXa結(jié)合，并競(jìng)爭(zhēng)性抑制其催化活性，進(jìn)而改變自身結(jié)構(gòu)，該過程是一個(gè)Ca²⁺非依賴的可逆性過程；然后，F(xiàn)Xa-TFPI復(fù)合物中的TFPI通過K1與FVIIa-TF復(fù)合物中的FVIIa活性部位相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)FVIIa-TF復(fù)合物的抑制。FXa輕鏈中谷氨酸殘基上的γ-羧基與Ca²⁺結(jié)合，并通過“鈣橋（Calcium Bridging）”結(jié)合于FXa-FVIIa-TF復(fù)合物中TF附近的磷脂表面，使得FXa-TFPI與FVIIa-TF形成穩(wěn)固的FVIIa-TF-FXa-TFPI四元復(fù)合物，滅活FVIIa-TF復(fù)合物，抑制外源性凝血途徑。因此，只有凝血途徑途徑啟動(dòng)后，TFPI才會(huì)發(fā)揮它的抑制凝血作用，從而調(diào)節(jié)TF的促凝活性。高濃度的TFPI在FXa缺乏的條件下可作為FVIIa-TF復(fù)合物的唯一生理抑制劑，抑制FVIIa-TF的活性，在外源性凝血途徑中發(fā)揮重要作用 ^[6] （圖3）。

圖3. TFPI抗凝血作用機(jī)制

4、TFPI在血友病、心血管疾病及腫瘤中的作用

● TFPI與血友病

血友病屬于一種單基因的X連鎖隱性疾病，其主要特征是出現(xiàn)活性凝血活酶生成障礙，也就是凝血因子缺乏導(dǎo)致的遺傳性出血性疾病，常表現(xiàn)為自發(fā)性出血或輕度外傷后出血不止。根據(jù)缺乏的凝血因子的種類不同，血友病主要分為血友病A和血友病B兩類，分別為凝血因子VIII和凝血因子IX缺乏所致。臨床上血友病A最常見，占比約80％-85% ^[7]。

如前所述，F(xiàn)VIIa-TF可以直接激活FX成為FXa。然而，TFPI可以滅活FXa與FVIIa-TF，所以，在生理止血的凝血過程中，組織因子TF的途徑作用是短暫的。凝血過程的維持與完成有賴于內(nèi)在途徑的存在，這也是血友?。ǚVⅢ、乏FIX、乏FXI）發(fā)生凝血障礙的主要原因。目前，凝血因子替代療法是血友病患者的主要治療手段，但是很多患者在接受治療過程中會(huì)產(chǎn)生凝血因子的抑制劑（免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體），從而影響治療效果。若設(shè)法消除TFPI的作用，則組織因子TF途徑的作用，就不再是短暫的，而能將凝血過程完成。在采用家兔型血友病模型中，應(yīng)用rTFPI抗體抑制TFPI，可使兔出血時(shí)間明顯縮短，這為血友病治療提供了一個(gè)新的途徑 ^{[8, 9]}。

● TFPI與心血管疾病

正常情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)TF，但多種心腦血管疾病，如心絞痛、冠狀動(dòng)脈或腦動(dòng)脈粥樣硬化等疾病狀態(tài)下，因血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，引起內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂而表達(dá)TF。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)，單核/巨噬細(xì)胞中的TF暴露在血循環(huán)中，具有促凝活性，誘導(dǎo)血栓發(fā)生。但TFPI可抑制TF，改善并發(fā)癥，調(diào)節(jié)血栓形成。此外，在心肌梗塞，冠狀動(dòng)脈局部缺血，動(dòng)脈粥樣硬化等疾病中，血漿TFPI水平增高，提示TFPI可以調(diào)節(jié)TF的活性，在抑制血栓形成和血管重塑等方面發(fā)揮重要作用 ^{[10, 11]}。

● TFPI與腫瘤

近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)凝血過程參與因子在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中常伴有異常表達(dá)。目前，TFPI在惡性腫瘤中的表達(dá)水平意見尚不一致。一方面，癌細(xì)胞和白血病原始細(xì)胞產(chǎn)生的IL-11和TNFa，可刺激TFPI的合成。另一方面，TFPI也屬于抗血管腫瘤新生因子之一，意味著TFPI也可能通過調(diào)節(jié)血管生成抑制腫瘤生長(zhǎng)。目前認(rèn)為，TFPI對(duì)抗腫瘤可能主要有兩種途徑：①抑制FVIIa-TF活性。TF可促進(jìn)血管新生、細(xì)胞遷移、細(xì)胞黏附和上調(diào)腫瘤細(xì)胞增殖。因此，TFPI可調(diào)節(jié)TF活性，抑制腫瘤 （圖4）；②TFPI通過與VLDL受體（極低密度脂蛋白受體）相互作用對(duì)抗血管新生、細(xì)胞增殖、腫瘤生長(zhǎng) ^{[13, 14]}。

圖4. TFPI抑制FVIIa-TF活性對(duì)抗腫瘤

5、TFPI的臨床研究進(jìn)展

來自PharmSanp的數(shù)據(jù)庫顯示，已有4款在研TFPI靶向藥物，主要適應(yīng)癥為血友病。其中，輝瑞公司有2款在研，分別是處于臨床3期的Marstacimab和臨床前的抗TFPI中和抗體。諾和諾德的Concizumab，也正在進(jìn)行臨床3期試驗(yàn)。此外，拜耳公司的BAY-1093884，已處于臨床2期。TFPI作為血漿中一種新近發(fā)現(xiàn)的抗凝蛋白，其作用是通過抑制FXa和FVIIa-TF發(fā)揮抗凝作用。近年，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，血漿TFPI含量改變，與心血管疾病、血友病、白血病和腫瘤相關(guān)。最值得期待的是，在血友病方面，多款TFPI靶向藥正在涌現(xiàn)，為血友病患者提供更多治療選擇。盡管凝血因子替代療法是目前市場(chǎng)上血友病療法的主流，但隨著技術(shù)的不斷突破，未來更多非凝血因子療法將獲得批準(zhǔn)，滿足不同血友病患者的需求。

為鼎力協(xié)助各藥企針對(duì)TFPI靶點(diǎn)在血友病、心血管疾病以及腫瘤等藥物方面的研發(fā)工作，CUSABIO推出TFPI活性蛋白產(chǎn)品（Code: CSB-MP023437HU；Code: CSB-MP023437RB），助力您在TFPI機(jī)制方面的研究或其潛在臨床價(jià)值的探索。

● Recombinant Human Tissue factor pathway inhibitor(TFPI),partial (Active)

High Purity Validated by Western Blot (WB)

Purity was greater than 95% as determined by SDS-PAGE. (Tris-Glycine gel) Discontinuous SDS-PAGE (reduced) with 5% enrichment gel and 15% separation gel.

Excellent Bioactivity Validated by Functional ELISA

Immobilized Human TFPI at 1 μg/ml can bind Anti-TFPI recombinant antibody (CSB-RA023437MA01HU), the EC₅₀ is 1.242-1.788 ng/mL.

● Recombinant Rabbit Tissue factor pathway inhibitor(TFPI) (Active)

High Purity Validated by Western Blot (WB)

Purity was greater than 95% as determined by SDS-PAGE. (Tris-Glycine gel) Discontinuous SDS-PAGE (reduced) with 5% enrichment gel and 15% separation gel.

Excellent Bioactivity Validated by Functional ELISA

Immobilized Rabbit TFPI at 1 μg/ml can bind Anti-TFPI recombinant antibody (CSB-RA023437MA01HU), the EC₅₀ is 2.281-3.783 ng/mL.