間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記物

1. 間充質(zhì)干細(xì)胞來源與分布

間充質(zhì)干細(xì)胞是1987年由Friedenstein等人 ^[1]利用自然貼壁法從獲得的骨髓基質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的概念最早在1991年由Caplan提出。

MSCs這一類群細(xì)胞的異質(zhì)性比較大，故無法定MSCs的發(fā)育起源。比如牙髓、皮膚等屬于外胚層來源，骨髓、脂肪組織、圍產(chǎn)期組織等則屬于中胚層來源。

間充質(zhì)干細(xì)胞廣泛存在于人體各組織中，可來源于骨髓，胰腺，皮膚肺等多處器官組織。也在許多其他的組織中發(fā)現(xiàn)有間充質(zhì)干細(xì)胞的存在，在滑膜、肝臟、肺臟、牙周質(zhì)、胰腺、眼結(jié)膜、脂肪、肌腱、甚至在羊水及頭皮組織中均可以培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞。

2. 間充質(zhì)干細(xì)胞的定義

自1991年MSCs的概念提出之后，在接下來的十年內(nèi)報(bào)告MSCs的組織類型激增。這就需要對MSCs的定義有一個(gè)明確的標(biāo)準(zhǔn)。

2006年，國際細(xì)胞療法協(xié)會（ISCT）制定了MSCs的定義的基本標(biāo)準(zhǔn)，也是MSC最低的鑒定標(biāo)準(zhǔn)：

• 在標(biāo)準(zhǔn)體外培養(yǎng)條件下呈貼壁生長狀態(tài)。
• 大于或等于95%的細(xì)胞表達(dá)CD105、CD73和CD90，且表達(dá)CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19或HLA-Ⅱ類分子的細(xì)胞不應(yīng)超過總數(shù)的2%^[2]
• 在體外誘導(dǎo)條件下，具有分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞的能力。

該標(biāo)準(zhǔn)存在的缺陷是對其在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)是否能真正分化未做要求，也沒有檢驗(yàn)其干性是否能維持。

不同來源的MSCs分子特征差異巨大^[3]。Caplan建議將其改為醫(yī)用信號細(xì)胞 (medicinal signaling cells，MSCs)^[4]。

3. 間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性

間充質(zhì)干細(xì)胞是一類能夠自我更新并具有多向分化潛能的典型細(xì)胞群體。在體外和體內(nèi)通過不同方式誘導(dǎo)分化為脂肪組織細(xì)胞、軟骨組織細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞和骨組織細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞。此外，研究表明，MSCs也可能被誘導(dǎo)分化為內(nèi)胚層細(xì)胞（肺細(xì)胞，肌細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞）及外胚層細(xì)胞（上皮細(xì)胞和神經(jīng)元）^{[5] [6]}。

間充質(zhì)干細(xì)胞具有獨(dú)特的細(xì)胞因子分泌功能，可分泌IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、干細(xì)胞生長因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、TGF-β等。

除了具有分化潛能外，間充質(zhì)干細(xì)胞具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)作用。

間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)機(jī)制可由分泌可溶性細(xì)胞因子如IL-10、TGF-β1、前列腺素E2、肝細(xì)胞生長因子、IL-2等介導(dǎo)。誘導(dǎo)CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可能干涉抗原呈遞細(xì)胞的成熟。

4. 間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用

MSCs對免疫系統(tǒng)的作用以負(fù)向調(diào)控為主。

• 單核細(xì)胞：單核細(xì)胞可分化為M1型Mφ起促炎作用或分化為M2型Mφ起抗炎作用。MSCs分泌IL-1RA、IL-10、CCL-18促使M1向M2轉(zhuǎn)化，通過影響Treg的形成，起到抗炎癥與負(fù)向調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能的作用。
• 中性粒細(xì)胞：在體內(nèi)，MSCs能夠通過加強(qiáng)中性粒細(xì)胞抗菌能力起到輔助清除細(xì)菌的作用，此外還能抑制中性粒細(xì)胞凋亡，延長中性粒細(xì)胞壽命。
• 樹突狀細(xì)胞：作為體內(nèi)最主要的專職抗原提呈細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞能夠有效刺激T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化，激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)MSC能夠顯著地減少單核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞的分化，維持樹突狀細(xì)胞的未成熟的狀態(tài)，從而使DC不能有效地活化初始T細(xì)胞和刺激T細(xì)胞增殖。
• T細(xì)胞：MSCs主要通過釋放可溶性因子、細(xì)胞間的直接接觸以及誘導(dǎo)Treg生成等三種方式抑制T細(xì)胞功能，這種抑制作用呈劑量依賴效應(yīng)。
• B細(xì)胞：MSCs會分泌一種細(xì)胞因子抑制B細(xì)胞增殖。MSCs通過使B細(xì)胞的細(xì)胞周期滯留在G0/G1期來達(dá)到目的。MSCs能夠產(chǎn)生趨化因子受體CXCR4/5/7來改變B細(xì)胞的趨化能力。

5. 間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記物

細(xì)胞的特定的功能與其表面標(biāo)志物相關(guān)，細(xì)胞表面標(biāo)記物可以體現(xiàn)細(xì)胞的一些基本特征^[7]。間充質(zhì)干細(xì)胞屬混雜細(xì)胞群，其表面抗原也具有非專一性，表達(dá)了間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞的表面標(biāo)志。目前人類間充質(zhì)干細(xì)胞表面比較肯定存在的標(biāo)記物有CD10，CD13，CD29，CD90和CD1，表面陰性的為CD14，CD34，CD45^{[8] [9]}。

CD29：CD29也被稱為整合素β1,VLA-β鏈或gpIIa，為多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的受體，是分子量為130 kDa的單鏈I型糖蛋白，屬于整合素家族。它廣泛表達(dá)于大多數(shù)造血細(xì)胞和非造血細(xì)胞，包括白細(xì)胞(雖然在粒細(xì)胞水平較低)、血小板、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和肥大細(xì)胞。CD29作為纖維連接蛋白受體，參與多種細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)多種重要的生物學(xué)功能，包括胚胎發(fā)育、傷口修復(fù)、止血和防止細(xì)胞程序性死亡。它的表達(dá)與MSC的遷移有關(guān)。

CD44：CD44也稱為Hermes、Pgp1、H-CAM或Hutch，是一種80-95 kDa的糖蛋白。它表達(dá)于白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞。CD44在B和T細(xì)胞的記憶階段高表達(dá)，被認(rèn)為是一個(gè)有價(jià)值的記憶細(xì)胞亞群的標(biāo)志物。

CD44是一種粘附分子，CD44抗原是一種細(xì)胞表面糖蛋白，CD44參與多種細(xì)胞功能，包括淋巴細(xì)胞活化、再循環(huán)和歸巢、造血和腫瘤轉(zhuǎn)移。

CD54：CD54也稱為ICAM-1，是一種分子量為85-110 kDa的I型跨膜蛋白，是免疫球蛋白超家族的成員。它表達(dá)于活化的內(nèi)皮細(xì)胞、高內(nèi)皮微靜脈、T、B細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。ICAM-1的表達(dá)可從細(xì)胞表面釋放。CD54可由IL-1和TNF-α誘導(dǎo)，并由血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞表達(dá)。CD54在細(xì)胞粘附中發(fā)揮作用，并參與炎癥和白細(xì)胞外滲。CD54也被證明是鼻病毒的主要細(xì)胞受體。

CD73：CD73是一種5′-核苷酸外切酶，又稱NT5E。它是一種69 kDa GPI錨定的表面蛋白。CD73廣泛表達(dá)于包括淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞。CD73不僅可參與嘌呤核苷酸的補(bǔ)救合成途徑，還可作為一種重要的免疫信號分子，參與跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞的黏附。CD73在間充質(zhì)干細(xì)胞表面的穩(wěn)定表達(dá)是鑒別MSCs重要的表面標(biāo)記之一。

CD90 (Thy1)：CD90也稱為Thy-1，是一種25-35kDa 的GPI錨定蛋白。它屬于免疫球蛋白超級家族。人CD90表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞、CD34+細(xì)胞亞群、胎肝細(xì)胞亞群、胎胸腺細(xì)胞亞群、成纖維細(xì)胞、活化內(nèi)皮細(xì)胞和某些白血病細(xì)胞系。Thy-1與與細(xì)胞的黏附、分化、細(xì)胞間相互作用有關(guān)。它是人類微血管內(nèi)皮細(xì)胞活化的標(biāo)記，與新生血管的形成有關(guān)^[10]；也是鑒別人類MSCs的重要標(biāo)記之一^[11]。

CD105 (Endoglin)：CD105也稱為endoglin，是透明帶蛋白(ZP)家族的一種90 kDa的I型跨膜糖蛋白糖蛋白。

Endoglin在足月胎盤增生的血管內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和合體滋養(yǎng)層細(xì)胞上高表達(dá)，在造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)嵴干細(xì)胞、活化的單核細(xì)胞以及淋巴和髓系白血病細(xì)胞上表達(dá)較少。在血管生成的組織中，如腫瘤、傷口愈合或真皮炎癥中，CD105在活化的內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)增加。Endoglin是TGFβ超家族配體的III型受體。CD105在血管發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，它可以維持血管的完整性^[12]。

CD106 (VCAM-1)：CD106又稱血管細(xì)胞黏附蛋白1(VCAM1)，INCAM-100和L1CAM，其編碼的蛋白是唾液酸糖蛋白，分子量為110kDa，由IL-1、TNF等細(xì)胞因子激活表達(dá)。

它是免疫球蛋白超家族成員，表達(dá)于炎癥血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上均有表達(dá)，在正常組織和炎癥組織中均有表達(dá)。它的表達(dá)與MSC的干性維持有關(guān)^[13]。

CD106介導(dǎo)白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可能在動脈粥樣硬化和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中起作用。

CD166 (ALCAM)：CD166又稱CD6配體或活化的白細(xì)胞粘附分子(ALCAM)，屬于免疫球蛋白超家族成員，是一種分子量為100-105kD的跨膜糖蛋白。

它表達(dá)于活化的T細(xì)胞、活化的單核細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和神經(jīng)元。ALCAM/CD6相互作用可能參與T細(xì)胞的發(fā)育和調(diào)節(jié)。此外，ALCAM/CD6和ALCAM/NgCAM相互作用可能在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用。ALCAM在高轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，并可能在腫瘤遷移中發(fā)揮作用。它還可以參與胚胎造血系統(tǒng)的發(fā)育和毛細(xì)血管的形成，并在維持MSCs多向分化潛能方面起著至關(guān)重要的作用^[14]。

CD349 (Frizzled-9)：CD349屬于“卷曲”基因家族的成員，這些蛋白是Wnt信號蛋白的受體。FZD9基因位于7號染色體的Williams綜合征常見缺失區(qū)，F(xiàn)ZD9基因的雜合性缺失可能與Williams綜合征的表型有關(guān)。FZD9主要在腦、睪丸、眼睛、骨骼肌和腎臟中表達(dá)。

STRO-1：Stro-1也是研究常用的標(biāo)志物，但在很多研究中均未提及^[15]。

作為尋找間充質(zhì)基質(zhì)/干細(xì)胞(mesenchymal stromal/stem cells，MSC)可靠標(biāo)志物的實(shí)驗(yàn)研究的一部分，Stro-1抗體是利用人CD34+骨髓細(xì)胞脾內(nèi)免疫小鼠產(chǎn)生的幾株雜交瘤中的一株產(chǎn)生的。Stro-1被認(rèn)為是最著名的MSCs標(biāo)記物，其抗體主要用于流式細(xì)胞術(shù)以及對可能的MSCs進(jìn)行染色。

TNAP：TNAP(組織非特異性堿性磷酸酶)抗原可以與W8B2抗體反應(yīng)。TNAP選擇性地表達(dá)在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞上。

CD34：CD34是一種跨膜唾液黏蛋白，可能與黏附和抗黏附有關(guān)。它是間充質(zhì)干細(xì)胞的陰性標(biāo)志物，一直以來備受爭議^[16]。爭議的點(diǎn)在于，分離得到的新鮮細(xì)胞（如內(nèi)皮細(xì)胞）是表達(dá)CD34的，但是隨著傳代次數(shù)的增加CD34逐漸消失，造血干細(xì)胞中也存在類似情況^[17]。也就是說MSCs不表達(dá)CD34是由細(xì)胞培養(yǎng)所致，并不符合其在體內(nèi)的真實(shí)狀態(tài)，所以是否應(yīng)將CD34作為MSCs的陰性標(biāo)志物應(yīng)重新考慮。

5.1 不同來源MSC的標(biāo)志物比較

目前臨床應(yīng)用較多的為骨髓來源MSC（bone marrow-MSC, BM-MSC）、臍帶來源MSC（umbilical cord-MSC, UC-MSC）和臍血來源MSC（UCB-MSC），不同來源MSCs既存在一些共性，也具有一些不同的特性。

UC-MSC的大多數(shù)免疫標(biāo)記物與BM-MSC的表達(dá)相似，不同的是，UC-MSC中HLA-ABC和CD106的表達(dá)低于BM-MSC。這提示UC-MSC比BM-MSC具有更低的免疫原性。CD106的低表達(dá)可能是UC-MSC與BM-MSC的鑒別點(diǎn)之一。

UCB-MSC和BM-MSC細(xì)胞表面標(biāo)志物比較一致。它們均表達(dá)CD29、CD44及CD105等細(xì)胞黏附分子，而不表達(dá)CD13、CD14、CD34及CD45，其免疫表型不隨著細(xì)胞傳代的增加而改變。

6. 間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用

間充質(zhì)干細(xì)胞的特點(diǎn)：具有自我更新，多向分化潛能，在體外能傳40代，并保持穩(wěn)定的表型和多向分化潛能。此外，它具有低免疫原性。

因此，間充質(zhì)干細(xì)胞可作為基因治療的載體細(xì)胞，修復(fù)各種組織和器官，如骨、軟骨、肌腱、皮膚、神經(jīng)組織、心肌，也可用于器官或組織移植。

目前應(yīng)用較多的有骨、軟骨和關(guān)節(jié)損傷的修復(fù)，造血干細(xì)胞移植治療移植物抗宿主病，自身免疫性疾病的治療，脊髓損傷和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。