構(gòu)建基因敲除的細(xì)胞系有哪些方法和步驟?
日期：2024-07-16 13:53:17
基因敲除常用于研究基因在細(xì)胞功能中的作用。下面是常用的基因敲除細(xì)胞系構(gòu)建方法和步驟：
插入突變（Knock-in）：通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源DNA片段插入至目標(biāo)基因位點，使目標(biāo)基因發(fā)生突變而實現(xiàn)基因敲除的目的。這個過程通常需要克隆目標(biāo)基因的編碼序列，并將突變（例如終止密碼子）或熒光標(biāo)記等片段插入其中。
CRISPR/Cas9敲除：利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，設(shè)計合成質(zhì)粒（sgRNA和Cas9蛋白），導(dǎo)入靶向基因組并誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂。通過細(xì)胞自我修復(fù)機(jī)制（非同源末端連接或同源重組），實現(xiàn)對靶向基因的敲除。
RNA干擾（RNAi）：通過轉(zhuǎn)染siRNA或shRNA質(zhì)粒，引入RNAi技術(shù)實現(xiàn)對特定基因的敲除。
背景細(xì)胞的選擇：基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建需要使用背景細(xì)胞，如CHO、HEK293等，根據(jù)需要選擇合適的背景細(xì)胞株。
細(xì)胞的篩選鑒定：針對基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建，需要通過PCR、Western blot或免疫組化等方法，對細(xì)胞系進(jìn)行篩選鑒定，確保目標(biāo)基因的敲除效果。
單克隆的建立：通過稀釋法或限稀釋法等方法，建立單克隆基因敲除細(xì)胞系，以保證其遺傳純度和穩(wěn)定性。
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